Imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller pendant la régénération rétinienne du poisson-zèbre

Résumé

Source : Lahne, M., et.al. Culture d’explants rétiniens de poisson-zèbre transgénique adulte pour l’imagerie de cellules vivantes par microscopie multiphotonique. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’imagerie de cellules vivantes de la migration nucléaire gliale de Muller dans des explants rétiniens de poisson-zèbre inclus dans de l’agarose suite à des lésions des photorécepteurs induites par la lumière. Le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) libéré par les photorécepteurs endommagés active les cellules gliales de Muller, déclenchant la migration nucléaire à travers les couches nucléaires internes et externes pour la mitose et la génération de progéniteurs neuronaux. Les images capturées révèlent la dynamique de la migration nucléaire et de la différenciation des progéniteurs au cours de la régénération rétinienne.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Microscopie multiphotonique

REMARQUE : Les expériences réalisées dans ce manuscrit ont été optimisées pour un microscope multiphotonique équipé d’un laser infrarouge (voir le tableau des matériaux), d’un objectif d’immersion dans l’eau longue distance Apo 40X (N.A. 1.15), d’un scanner galvanométrique et d’une chambre environnementale contenant un insert pour quatre boîtes de Pétri de 35 mm. Les images ont été acquises à l’aide d’un détecteur non désançonné (R-NDD).

1. Avant l’imagerie, équilibrez la chambre environnementale pour obtenir une atmosphère de 5 % de CO₂ par air. Assurez-vous que des boîtes de Pétri vides sont insérées dans le support pour éviter les fuites de gaz dans la pièce.
2. Allumez le système de microscopie.
3. Une fois la chambre environnementale équilibrée, ajoutez du liquide à indice de réfraction sur l’objectif d’immersion dans l’eau longue distance 40X Apo (N.A. 1.15).
   REMARQUE : Le liquide à indice de réfraction avec des propriétés optiques similaires à celles de l’eau est utilisé pour éviter l’évaporation de l’eau lors de l’imagerie à long terme.
4. Placez des fluoroplats avec des explants rétiniens dans la chambre. À l’aide d’une lumière à fond clair, positionnez l’échantillon dans le trajet de la lumière et amenez la région médiane de la rétine dorsale dans le plan de mise au point.
5. Utilisez la lumière épifluorescente GFP pour faire la mise au point sur les noyaux gliaux de Müller gfap :nGFP-positifs (Figure 1A, C).
   REMARQUE : Si les explants ne sont pas montés à plat ou si l’agarose s’accumule sous l’explant, il sera difficile de se concentrer sur les noyaux positifs gfap :nGFP ou ils deviendront faiblement fluorescents.
   1. Vérifiez si le fait de passer à une autre région au sein du même explant rétinien résoudra le problème de mise au point. Sinon, passez à un autre explant rétinien.
6. Dans le logiciel d’acquisition d’images, ouvrez les fenêtres « A1 MP GUI », « TiPad », « A1 Compact GUI » et « ND acquisition ». Pour l’imagerie multiphotonique, assurez-vous que l’option « IR NDD » est choisie dans l’interface graphique compacte A1.
7. Dans le champ 'setting', sélectionnez IR-DM pour le 1er miroir dichroïque et choisissez le filtre passe-bande 525/50 pour acquérir la fluorescence GFP.
8. Allumez le laser IR dans la fenêtre étiquetée « A1MP GUI ». Il faudra quelques minutes pour que le laser soit prêt. Réglez la longueur d’onde sur 910 nm pour exciter la fluorescence GFP et aligner le laser en cliquant sur le bouton « Alignement automatique » dans la fenêtre « A1 MP GUI ».
9. Assurez-vous que les lumières de la pièce et de l’équipement sont éteintes ou couvertes avant d’ouvrir l’obturateur dans l’interface graphique A1 MP afin d’éviter une surexposition du tube photomultiplicateur. Pour réduire les niveaux de bruit, placez le microscope dans un environnement sombre.
10. Acquérez des images d’un champ de vision de 300 x 300 pixels, avec un zoom de deux et un temps d’habitation des pixels de 4,8 μs/pixel. Configurez grossièrement la puissance laser en changeant la 'zone d’acquisition' dans l''interface graphique A1MP et le gain dans la fenêtre 'A1 Compact GUI'
.
11. Configuration de la pile z
    1. Focus sur la couche de cellules ganglionnaires (GCL) pour définir le plan focal supérieur de la pile z dans la sous-fenêtre 'z' de la fenêtre 'acquisition ND'. Certaines cellules gfap :nGFP-positives sont généralement situées dans la couche de cellules ganglionnaires, ce qui aide à identifier la limite basale de la rétine (Figure 1A, D).
    2. Déplacez le plan focal à travers le niveau de la couche nucléaire externe (ONL) (Figure 1A, B), qui est caractérisée par la présence de cellules gfap :nGFP-positives faiblement marquées qui sont rondes et élargies par rapport à leurs homologues de la couche nucléaire interne (INL) (Figure 1A, C).
    3. Définissez ce plan comme le bas de la pile z. Assurez-vous que l’ensemble de l’ONL sera imagé (Figure 1A, B).
    4. Lorsque vous rencontrez des décalages du plan focal qui nécessitent un réajustement pendant la période d’imagerie, double-cliquez sur la position médiane dans la sous-fenêtre « z » pour l’attribuer comme position « d’origine ». Passez en « mode symétrique défini » et cliquez sur « relatif ».
    5. Réglez la taille du pas z entre 0,7 et 1 μm.
12. Correction de l’intensité Z :
    1. Applique des corrections d’intensité z pour compenser la perte d’intensité des pixels due à la diffusion de la lumière lors de l’imagerie dans les couches profondes du tissu.
    2. Pour configurer la correction, ouvrez la fenêtre « Correction de l’intensité z ». Pour définir la plage de la pile z, choisissez « À partir de ND ».
    3. Cliquez sur le plan focal inférieur dans la fenêtre 'correction de l’intensité z' (dans ce cas, correspond à la couche de cellules ganglionnaires) et réglez l’intensité laser ('zone d’acquisition' dans l''interface graphique A1MP) et le gain (interface graphique compacte A1).
    4. Cliquez sur la flèche à côté des « valeurs z » dans la fenêtre « Correction de l’intensité z » pour confirmer les paramètres qui sont ensuite affichés sous « Paramètres de l’appareil » dans la fenêtre « Correction de l’intensité z » pour le plan focal choisi.
    5. Répétez le processus pour les plans central et supérieur, en augmentant la puissance et le gain du laser. Des plans focaux supplémentaires peuvent être ajoutés si nécessaire. Voir le Tableau 1 pour les réglages spécifiques du laser et du gain pour les expériences des figures 1 à 3.
    6. Définissez la 'zone d’acquisition' dans la fenêtre 'A1 MP GUI'. Évitez de sélectionner une zone d’acquisition supérieure à 15 et un gain supérieur à 126 au début de l’imagerie pour contourner le photoblanchiment et l’augmentation des niveaux de bruit.
       REMARQUE : Comme les lasers et les tubes photomultiplicateurs diffèrent entre les systèmes de microscopie, testez les paramètres du laser et du gain pour obtenir des conditions d’imagerie optimales pour la configuration du microscope tout en évitant le photoblanchiment.
    7. Choisissez « Correction de l’intensité relative » dans la fenêtre « Correction de l’intensité z ».
13. Dans la sous-fenêtre 'séries temporelles' de la fenêtre 'Acquisition ND', réglez la durée sur 8 h et l’intervalle sur 'aucun délai'. Ensuite, assurez-vous de cliquer sur le bouton « Exécuter la correction z » dans la sous-fenêtre « z-stack » dans le bouton de la fenêtre « Acquisition ND » pour acquérir la série temporelle 3D.
14. Maintenir les explants rétiniens à une température de 27 à 29 °C pendant toute la durée de l’acquisition de l’image.
15. Tout au long de la période d’acquisition de l’image, si nécessaire, réajustez le niveau de puissance et le gain afin de maintenir la qualité de l’image pour l’analyse post-imagerie. Pour les réglages, effectuez les étapes 1.11.2 à 1.11.4.
16. Si le plan focal se décale, mettez en pause ou arrêtez l’exécution et effectuez à nouveau l’étape 1.11.
    REMARQUE : Si la « correction z relative » a été choisie à l’étape 1.12.7 et que l’étape 1.11.4 a été effectuée, il ne devrait pas être nécessaire de réajuster les niveaux de puissance et de gain, à moins qu’un photoblanchiment important ne se produise.

Tableau 1 : Niveaux du laser et du gain utilisés pour les corrections d’intensité z dans les différents plans des expériences illustrées aux figures 1 à 3.

	Tg[gfap :EGFP]nt11		Tg[rho :Eco.NfsB-EGFP]nt19
	Puissance laser	Gain	Puissance laser	Gain
Haut (photorécepteur de bâtonnet)	13	126	3,5	118
Milieu (glie de Muller)	10	126	2,8	118
Bas (couche de cellules ganglionnaires)	8	126	2,1	118

Résultats

Figure 1 : Reconstruction 3D d’empilements z multiphotoniques rétiniens. A) reconstruction 3D d’une série d’images multiphotoniques z-stack de gfap :nGFP- cellules positives dans des cultures rétiniennes entières de poissons-zèbres aprè...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Fluordishes	World precision instruments	FD35-100
Stereomicroscope	Nikon	SMZ-1B	Un type similaire de stéréomicroscope à dissection fonctionnera
Lampes fluorescentes Sylvania OSFP5835HOECO	Bulbtronics	31850
Indice de réfraction liquide	Cargille Lab	1803Y
Le microscope multiphotonique Nikon A1 équipé d’un laser infrarouge MaiTai	Nikon		Equivalent fonctionnera avec
objectif d’immersion dans l’eau longue distance 40x Apo (N.A. 1.15) Chambre environnementale équipée d’un insert pour paraboliques de 35 mm	Système équivalent Okolab		fonctionnera
logiciel d’analyse NIS	Nikon

Le système un