Imagerie des lésions cérébrales induites par l’hypoxie-ischémie cérébrale dans un modèle murin

Résumé

Source : Ouyang, Y., et al. Imagerie TEP/IRM simultanée au cours de l’hypoxie-ischémie cérébrale de la souris. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo présente une technique permettant d’évaluer les lésions d’hypoxie cérébrale par tomographie par émission de positrons (TEP) et imagerie par résonance magnétique (IRM) simultanées. Une souris anesthésiée subit une ligature de l’artère carotide commune (ACC), réduisant le flux sanguin vers un hémisphère cérébral et le prédisposant aux lésions induites par l’hypoxie. L’imagerie TEP et IRM évalue le métabolisme du glucose et les changements structurels pendant l’hypoxie. L’IRM détecte une diffusion restreinte de l’eau, tandis que la TEP révèle une réduction de l’absorption de glucose, indiquant un stress cellulaire induit par l’hypoxie et une altération métabolique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Ligature unilatérale de l’artère carotide commune (ACC)

1. Préparez le champ stérile avec des outils et des matériaux chirurgicaux stérilisés positionnés de manière pratique. Assurez-vous que le coussin chauffant est chauffé à 37 °C avec la sonde de température bien placée sur le coussin. Assurez-vous d’utiliser un champ stérile pour couvrir le site chirurgical.
2. Anesthésier l’animal (isoflurane, 1-3 % dans l’air à 0,5-1 L/min) et placer l’animal en position couchée, la queue tournée vers l’extérieur. Vérifiez l’anesthésie en pinçant l’orteil - cela ne devrait provoquer aucune réaction si l’animal est correctement anesthésié. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
3. Appliquez la crème épilatoire sur le bas du cou jusqu’au haut de la poitrine à l’aide de 1 à 2 cotons-tiges. Attendez 1 à 3 minutes, puis retirez les cheveux et la crème à l’aide de gaze humide ou de tampons imbibés d’alcool. Frottez la zone d’incision avec de la bétadine de manière circulaire de l’intérieur vers l’extérieur, puis passez à des gants chirurgicaux stériles.
4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une incision d’environ 1 cm le long de la ligne médiane de la partie inférieure du cou. Séparez soigneusement la peau externe du fascia environnant à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
5. À l’aide de deux pinces de suture à micro-iris McPherson, séparez l’artère carotide commune droite du fascia, en prenant soin d’éviter d’endommager les veines ou de perturber le nerf vague.
6. À l’aide de la pince à droite, extériorisez le CCA droit dans une position stable. Appliquez plusieurs gouttes de solution saline pour éviter le dessèchement. Passez une longueur appropriée (2-3 cm) de suture en soie 6-0 sous le CCA droit et ligaturez à l’aide d’un double nœud carré. Si vous le souhaitez, ligaturez à nouveau à l’aide d’une deuxième longueur de suture en soie 6-0.
7. Repositionnez l’ACC droit et nettoyez l’excès de liquide de l’ouverture à l’aide d’un écouvillon stérile à pointe d’éponge. Fermez l’incision avec une suture en soie 6-0. Appliquer la lidocaïne par voie topique jusqu’à 7 mg/kg.
8. Laisser l’animal se remettre de l’anesthésie jusqu’à l’ambulatoire (environ 30 min) et effectuer un suivi post-chirurgical jusqu’à ce que l’animal soit prêt pour l’imagerie.

2. Préparation à l’imagerie : vérifications du système et du matériel

1. Configurez le matériel et les logiciels pour les systèmes d’IRM et de TEP et vérifiez leur fonctionnalité comme suit. Assurez-vous que toutes les connexions physiques sont sécurisées et que les paramètres logiciels sont correctement sélectionnés.
   1. Assurez-vous que le système PET est à la température de fonctionnement prescrite de 5 °C en utilisant le système de refroidissement par air.
   2. Montez le système TEP à l’intérieur de l’alésage de l’IRM, en alignant les centres du champ de vision (FOV) de la TEP et de l’IRM à l’aide de décalages axiaux connus. Montez la bobine IRM à l’intérieur de l’alésage du système TEP et centrez la bobine avec le système TEP et les centres magnétiques IRM.
   3. Activez l’électronique PET pour l’alimentation et la tension de polarisation (Remarque : les étapes varient selon l’instrument). Effectuez un balayage rapide (5 min) à l’aide d’une bouteille 68Ge et vérifiez le sinogramme résultant pour vous assurer que tous les détecteurs sont opérationnels.
   4. Acquérez éventuellement des données à utiliser pour une matrice de transformation TEP/IRM à des fins de co-enregistrement : remplissez un fantôme tridimensionnel (par exemple, trois sphères remplies) avec 200 μCi de solution aqueuse 18F et acquérez pendant 15 min avec PET. Acquisition de données anatomiques d’IRM : dans la fenêtre de contrôle du balayage, sélectionnez la séquence multi-coupes multi-échos (MSME) (voir Tableau 1). Répétez l’opération pour les trois orientations principales : axiale, sagittale et coronale.
2. Vérifiez les paramètres et le fonctionnement de la pompe à perfusion. Réglez la pompe à 4,44 μl par minute, ce qui, en 45 minutes de perfusion constante, fournit un volume total de 200 μl, la limite recommandée typique pour l’injection intraveineuse (IV) chez un animal de 20 g.
3. Vérifiez le fonctionnement de l’appareil de chauffage et confirmez que la température de sortie est suffisante pour garder l’animal au chaud (37 °C). Vérifier que la surveillance de la température et de la respiration est opérationnelle en prévision du placement de l’animal sur le lit d’animal.
4. Vérifiez le fonctionnement des débitmètres O2 et N2 (pour 0,5 L/min : O2 à 57,2 mg/min et N2 à 0,575 g/min) en allumant les deux avec la source d’air comprimé éteinte et les sources O2 et N2 allumées. Pour éviter le risque d’endommager les débitmètres, ne les allumez pas sans une pression d’entrée suffisante.
5. Assurez-vous que le vaporisateur d’isoflurane est suffisamment rempli. Avant l’imagerie, commencer le débit d’anesthésie à l’isoflurane à 1-2 % et 0,5 à 1 L/min.
6. Préparez le lit de l’animal en vous assurant que les systèmes d’anesthésie, de protection respiratoire et de chauffage sont bien placés et fonctionnels. Pour une précision supplémentaire du co-enregistrement TEP/IRM, des marqueurs repères (par exemple, des tubes capillaires remplis de radiotraceur à une concentration similaire à celle injectée pour l’imagerie) peuvent être fixés au lit de l’animal dans le champ de vision.

3. Flux de travail d’imagerie

Une fois toutes les vérifications nécessaires de l’équipement terminées, procédez à l’imagerie comme suit :

1. Anesthésiez l’animal avec de l’isoflurane et insérez un cathéter veineux de la queue (aiguille de 28 g, tube PE-10 de moins de 5 cm) rempli de solution saline héparinée (0,5 ml d’héparine, 1 000 USP/ml, dans 10 ml de solution saline). Le réchauffement de l’animal et/ou de la queue peut améliorer la précision d’insertion du cathéter. Placez éventuellement une goutte d’adhésif cyanoacrylate sur le site d’insertion pour fixer la ligne IV.
2. Transférez l’animal dans le lit d’animal préparé. Assurez-vous que la tête de l’animal est bien fixée, avec les incisives supérieures sécurisées par la barre dentaire et les barres d’oreille en place si vous l’utilisez.
3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement. Insérez le thermomètre à sonde rectale. Assurez-vous que les relevés de température et de respiration sont fonctionnels.
4. Prélever la dose de radiotraceur (environ 600 μCi dans 200 μl) à injecter dans une tubulure héparinée en PE-10 de longueur appropriée – environ 3 m pour une tubulure en PE-10 et un volume de 200 μl. Connecter une extrémité de cette tubulure à la seringue de la pompe à perfusion et l’autre à la ligne du cathéter de la veine de la queue, en prenant soin de ne pas créer de perforations dans le tube.
5. Faites glisser le lit de l’animal vers l’avant dans l’alésage de l’aimant, en veillant à ne pas perturber le positionnement de la bobine d’IRM et des lignes ou câbles, en particulier la tubulure d’anesthésie. Assurez-vous que le centre du cerveau est aligné avec les centres de la bobine d’IRM, du système TEP et de l’aimant IRM.
6. Effectuez le réglage et l’adaptation de la bobine IRM en tournant les boutons de réglage sur la bobine, en minimisant les incompatibilités d’impédance (vérifier les spécifications de la bobine) et de fréquence (300 MHz pour 1H à 7 Tesla) en observant l’affichage du préamplificateur haute puissance.
7. (MRI) Après le réglage et la correspondance, acquérez une image d’éclaireur : sélectionnez une séquence tripilote RARE (Rapid Imaging with Refocused Echoes) et exécutez-la à partir de la fenêtre de contrôle de balayage. Vérifiez le positionnement de l’animal, en répétant les étapes 3.5 et 3.6 si nécessaire. Réinitialisez les cales à zéro.
8. (IRM) Acquisition d’un balayage spectroscopique localisé à résolution ponctuelle (PRESS) dans un volume du cerveau : exécutez une séquence PRESS (voir Tableau 1) dans un volume rectangulaire de dimensions 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Vérifiez la largeur de la conduite d’eau à l’aide de la macrocommande CalcLineWidth. Si la valeur de la largeur totale à mi-maximum (FWHM) est acceptable (par exemple, 0,2 ppm), passez à l’étape 3.10. Si ce n’est pas le cas, passez à l’étape 3.9.
9. (MRI) Acquérir une carte de terrain : Exécutez une séquence FieldMap (voir Tableau 1). Utilisez les données résultantes pour une cale de projection multiangle (MAPSHIM) en exécutant la commande macro MAPSHIM et en sélectionnant les réglages locaux linéaires et de second ordre (z2). Répétez l’étape 3.8.
10. (IRM) Positionnez le plan de coupe pour le balayage d’imagerie pondéré en diffusion (DWI) (voir Tableau 1) : à l’aide de l’éditeur de géométrie, assurez-vous que le champ de vision d’acquisition est positionné de manière à acquérir le volume d’intérêt souhaité dans le cerveau. Si le plan de coupe résultant est aligné comme vous le souhaitez, copiez-le dans la fenêtre de contrôle de balayage pour toutes les analyses DWI ultérieures. Commencer l’acquisition.
11. (PET) Avec l’acquisition TEP préparée et prête à commencer, démarrez la pompe à perfusion. Après le délai prédéterminé pendant lequel la solution saline du cathéter a été injectée, commencer l’acquisition TEP (voir tableau 1) afin de capturer l’entrée du radiotraceur. Surveillez le taux de numération et recherchez une augmentation progressive du nombre de numérations indiquant une injection réussie.
12. Après 10 à 15 minutes, amorcez la procédure de provocation hypoxique en même temps que l’étape 3.12. Pour initier une provocation hypoxique, coupez le débit d’air médical et allumez immédiatement les débitmètres O2 et N2 avec les réglages prédéterminés pour fournir 8 % d’oxygène et 92 % d’azote, et réduire l’isoflurane à 0,8 %. N’allumez pas les débitmètres sans pression d’entrée.
13. (IRM) En même temps que l’étape 3.12, commencer l’acquisition de la DWI préparée à l’étape 3.10 (balayage « H1 »).
14. (IRM) Commencer l’acquisition de la DWI (balayage « H2 »), préparée à l’étape 3.10, immédiatement après la fin du balayage H1. Mettez fin à la provocation hypoxique en éteignant les débitmètres, en rétablissant le débit d’air médical et en ramenant la concentration d’isoflurane à une valeur appropriée basée sur la surveillance physiologique.
15. (IRM) Procurez-vous un examen de la conduite avec facultés affaiblies post-hypoxie préparé à l’étape 3.10. Éteignez la pompe à perfusion une fois cette analyse terminée.
16. (IRM) Acquérir des images anatomiques dans les plans axial et sagittal. Dans la fenêtre de contrôle de balayage, sélectionnez la séquence MSME (voir Tableau 1). À l’aide de l’éditeur de géométrie, assurez-vous que le champ de vision d’acquisition couvre le cerveau.
17. Retirer l’animal, le remettre dans la cage lorsqu’il est ambulatoire et surveiller les signes de morbidité, l’euthanasier si nécessaire avec l’administration de CO2 suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire.

Tableau 1. Paramètres de séquence d’impulsions IRM pour les balayages décrits dans le protocole, et paramètres d’acquisition, d’histogramme et de reconstruction TEP.

Paramètres d’acquisition d’imagerie et acquisition
IRM DE DIFFUSION (EPI-DWI)
Temps d’acquisition	15 min
Taille de la matrice	256 x 64
Tranches	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Taille du voxel	0,117 x 0,219 x 0,8 mm
Bande passante spectrale effective	150 kHz
TE	41 ms
TR	3 000 ms
Moyennes 6
segments d’espace k	16
valeurs b	0, 400, 800 sec/mm2
IRM anatomique (MSME)
Temps d’acquisition	5 min
Taille de la matrice	256 x 256
Tranches	16
Champ de vision	30 x 22 x 12,8 mm
Taille du voxel	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 ms
TR	1 000 ms
Moyennes	1
Répétitions	1
Balayage spectroscopique à résolution ponctuelle (PRESS)
Temps d’acquisition	15 s
Taille du voxel	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 ms
TR	2 500 ms
Moyennes	6
FieldMap
Temps d’acquisition	1 min 21 s
1er TE	1,49 ms
2e TE	5,49 ms
TR	20 ms
Moyennes	1
Acquisition TEP, histogramme, et paramètres de reconstruction
Tracer	[18F]FDG
Taux d’infusion	4,44 μL/min
Temps d’acquisition	60 min
Taille de l’image par tranche	128 x 128
Tranches	99
Taille du voxel	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Cadrage dynamique	12 x 300 s
Type de reconstruction	OS-MLEM (6 sous-ensembles, 6 itérations)

matérielle

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ciseaux chirurgicaux	Roboz	RS-5852
Forceps	Roboz	RS-5237
Hartman Pince à moustiques	Miltex	7-26
2x pince à suture McPherson, 8,5 cm	Instruments chirurgicaux et scientifiques précis	4473	Il est utile de réduire la largeur d’ouverture avec une bande sur la pince utilisée pour maintenir l’artère carotide
6-0 Suture en soie tressée enduite de silicone avec aiguille 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
Système de couverture homéothermique	Harvard Apparatus	507220F
Super Débitmètre
pour O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
Flomètre pour N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
O₂mètre	MSA	Altair Pro
Imagerie
Système d’IRM 7,05 Tesla	Bruker	BioSpec	Diamètre intérieur de l’alésage de 20 cm avec jeu de gradient. Logiciel Paravision 5.1.
Bobine de volume Tx/Rx 1H, 35 mm ID	Bruker	T8100
Système PET	(interne)		4x24 détecteurs LSO-PSAPD,
10x10 réseau LSO par détecteur,
pas de cristal de 1,2 mm et profondeur de 14 mm. 14 x 14 mm PSAPD. Champ de vision : 60 x 35 mm. Fenêtre d’énergie 350-650 keV. Fenêtre de chronométrage de 16 ns.
Moulage de vaisseau Pince Dumont	Roboz	RS-4991
Tube en polyéthylène PE-10	BD Intramedic	427401
Pompe à perfusion	Braintree Scientific	BS-300
Équipement de surveillance et de contrôle des animaux	Small Animal Instruments Inc.	Modèle 1025	Uniquement surveillance respiratoire utilisé
Lit d’animal avec régulation de la température	(interne)

d’hypoxie à colle (générique)