Imagerie ex vivo de la migration postnatale des cellules granulaires cérébelleuses à l’aide de la macroscopie confocale

Résumé

Source : Bénard, M., et al. Ex Vivo Imagerie de la migration cellulaire granulaire cérébelleuse postnatale à l’aide de la macroscopie confocale. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo présente une méthode macroscopique confocale pour suivre la migration ex vivo des cellules granulaires dans des tranches cérébelleuses à partir de cerveaux de rats postnatals.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Coloration fluorescente d’interneurones vivants

1. Transférez les tranches cérébelleuses à l’aide d’une pipette Pasteur tronquée en verre de large calibre dans une plaque à 6 puits (max 3 tranches/par puits). Aspirez le milieu de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS).

2. Incuber des tranches (3 max) dans 5 ml de solution de chargement du colorant fluorescent (10 μM).

3. Pour protéger de la lumière, couvrez la microplaque de papier d’aluminium. Posez-le sur une table gyroscopique à 35 tr/min pendant 10 min à RT pour faciliter le marquage des cellules.

4. Coupes de transfert sur la membrane d’un insert Transwell (taille des pores de 3,0 μm ; Figure 1D) avec une pipette Pasteur tronquée en verre de large calibre. Aspirer le milieu de chargement à l’aide d’une pipette.

5. Retirez l’insert et remplissez le puits avec 1,9 ml de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM). Replacez l’insert et ajoutez 100 μl de DMEM sur le dessus de la tranche pour couvrir le tissu.

6. Placez la plaque contenant les inserts de culture dans la chambre d’incubation (37 °C, 5 % CO₂) pendant 2 heures, ce qui est suffisant pour observer les cellules granulaires (GC) dans la couche moléculaire (ML). Étendez les tissus à plat pour permettre la fixation sur la membrane d’insertion (Figure 1E). Assurez-vous que les tranches ne sèchent pas.

2. Ex vivo Imagerie par macroscopie confocale

1. Transférez la plaque sans le couvercle en plastique dans un incubateur fixé au support d’un macroscope confocal. Placez un couvercle en verre sur l’insert de la plaque du macroscope. Maintenez la température de la chambre à 37,0 °C ± 0,5 °C et alimentez les tranches avec un débit de gaz constant (95 % O₂, 5 % CO₂) à travers l’insert de plaque pour maintenir le pH constant. Attendez 2 heures supplémentaires avant l’expérience en accéléré.

2. Pour visualiser la migration GC dans les coupes de tissu, éclairer la préparation avec une lumière de longueur d’onde de 488 nm au moyen d’une diode laser à travers un macroscope confocal à balayage laser équipé d’un objectif sec X2 (distance de travail : 39 mm, diamètre : 58 mm, NA = 0,234), et détecter l’émission de fluorescence de 500 à 530 nm.

1. Pour résoudre finement le mouvement des GC, acquérez des images avec un facteur de zoom optique supplémentaire de 1,5 à 2,0. Collectez des images de GC dans un seul plan focal ou jusqu’à 10 plans focaux différents le long de l’axe z toutes les 30 minutes pendant une durée maximale de 12 heures.

3. Si nécessaire, retirez le couvercle en verre et ajoutez de petits volumes (1-10 μl) d’activateurs ou d’inhibiteurs biologiques dans du DMEM à l’aide d’une pipette de 10 μl pour étudier leur effet sur la migration des GC.

3. Suivi cellulaire

1. Pour chaque fois de la vidéo, effectuez une projection z-stack via le mode de type ecart dans ImageJ. Moduler les niveaux de contraste et de luminosité des images successives pour faciliter l’identification et le suivi des GC étiquetés. Cartographier manuellement chaque position sur l’instantané de référence (à t = 0).

1. Utilisez le plugin « Suivi manuel » dans le menu Analyser les particules et déterminez en cliquant sur le point de gravité de chaque corps de cellule pendant le timelapse. Exportez les données de suivi brutes dans une feuille de calcul.

2. Réorganisez les données de suivi brutes exportées d’ImageJ avec un programme intelligent fait maison qui identifie chaque cellule et les positions associées. À l’aide du programme, calculez la distance totale parcourue et la vitesse moyenne de migration pour chaque cellule. Classifiez et comparez les caractéristiques de la migration cellulaire dans des conditions de contrôle et de traitement sous des filtres appropriés à l’aide du même programme.

Résultats

Figure 1 : Ex vivo culture de tranches cérébelleuses P10. (A) Cervelet disséqué du rat P10. Barre d’échelle = 6 mm. (B) Micrographie d’une coupe cérébelleuse vivante de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
mélange de nutriments Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) F-12	Sigma-Aldrich	D8437
Cell Tracker Green CMFDA	Invitrogen	C2925
Polyester Transwell-Clear inserts	Corning	3452
6-well Cell grappe de culture	Corning	3516
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
Gyro-rocker, SSL3	Incubateur CO₂ Stuart
, Hera Cell 150	Thermo Scientific
Macroscope confocal, TCS LSI	Leica Microsystems
₂-controller	PeCon
Hank’s balanced salt solution 10x	Sigma-Aldrich	H1641
Pipette à volume réglable (0,5-10μL)	Eppendorf	4910 000.018
Régulateur de température	PeCon

CO