Imagerie en accéléré de la division de cellules souches neurales de souris à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Source : Daynac, M., et. al. Tri cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices de la zone subventriculaire de la souris adulte et imagerie en direct de la dynamique de leur cycle cellulaire. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre l’imagerie en accéléré de cellules souches neurales (NSC) à partir du cerveau d’une souris transgénique à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les NSC deviennent fluorescentes en rouge pendant la phase G1 et ne sont pas fluorescentes dans les autres phases du cycle cellulaire. Une culture NSC collée est placée dans la chambre d’imagerie, les paramètres d’imagerie sont définis et les images sont capturées à intervalles réguliers pendant la durée souhaitée.

Protocole

1. Configuration de base avant la culture et la vidéomicroscopie

1. Utilisez des plaques de culture à fond de verre ou des plaques μ pour la vidéomicroscopie confocale. Pour 1 à 5 x 10³ cellules/puits, utilisez des plaques à 96 puits, et pour plus de 5 x 10³ cellules/puits, utilisez des plaques à 24 puits.
2. Au moins un jour avant le début de l’expérience, préparer des plaques stériles revêtues de poly-D-lysine (PDL) pour les cultures monocouches adhérentes. Ajouter suffisamment de PDL (10 μg/ml dans de l’eau distillée ou dH₂O) pour enrober le fond de chaque puits et incuber toute la nuit (O/N) à 37 °C. Retirer la solution de PDL et rincer trois fois avec dH₂O avant de laisser la plaque sécher dans la hotte pendant au moins 2 heures sous un flux laminaire. S’il n’est pas utilisé immédiatement, conserver la plaque revêtue à -20 °C.
3. Préparez le milieu de culture en mélangeant le milieu de base des cellules souches neurales (NSC) et le supplément de prolifération des NSC dans un rapport de 9:1 (voir le tableau des matériaux) avec 2 μg/ml d’héparine, 20 ng/ml de facteur de croissance épidermique recombinant humain purifié (EGF), et 10 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes recombinants humains 2 (FGF-2). Réchauffez le milieu de culture à 37 °C au bain-marie avant utilisation.
4. Pour la dissociation de la zone sous-ventriculaire (SVZ), préparer une solution de papaïne : 1 mg/ml de papaïne (15 UI/ml) dans une solution saline d’Earl’s Balance (EBSS) contenant 0,2 mg/ml de L-cystéine, 0,2 mg/ml d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et 0,01 mg/ml de DNase I dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Stérilisez la solution en la faisant passer à travers un filtre de 0,2 μm. Équilibrez la solution à 37 °C avant utilisation.
5. Pour arrêter la réaction enzymatique, préparez une solution d’inhibiteur de protéase (Ovomucoid) : milieu d’aigle modifié de dulbecco (DMEM) : milieu F12 contenant 0,7 mg/ml d’inhibiteur de trypsine de type II. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm.
6. Préparez une solution de glucose PBS à 0,6 % pour recueillir les cerveaux et une solution d’albumine sérique bovine (BSA) PBS à 0,15 % pour les étapes de lavage et pour la coloration des anticorps.
7. Préparez des outils de dissection : ciseaux, pinces à disséquer et à attacher et un scalpel. Trempez-les dans de l’éthanol à 70 %.

2. Prélèvement de cerveaux de souris adultes et de microdissections SVZ

1. Sacrifier des souris adultes immuno-indicatrices du cycle cellulaire d’ubiquitination par fluorescence (FUCCI) (âgées de 2 à 3 mois et/ou de 12 mois pour les études sur le vieillissement), en effectuant une luxation cervicale conformément aux directives institutionnelles appropriées.
2. Vaporisez la souris avec de l’éthanol à 70 % et coupez la tête à l’aide de ciseaux bien aiguisés.
3. Faites une incision le long du cuir chevelu pour révéler le crâne.
4. Effectuez une coupe longitudinale médiane en partant de la base du crâne vers les bulbes olfactifs à l’aide d’une petite paire de ciseaux. Assurez-vous d’éviter d’endommager le cerveau sous-jacent avec les lames de ciseaux. Retirez la partie supérieure ouverte du crâne à l’aide d’une pince incurvée pour exposer le cerveau.
5. Prélevez le cerveau dans une boîte de Pétri de 15 mm contenant 0,6 % de glucose dans du PBS.
6. Disséquez les bulbes olfactifs. Placez le cerveau sur sa face dorsale et faites une section coronale à travers le chiasma optique à l’aide d’un scalpel.
7. Sous un microscope à dissection, positionnez la partie rostrale de la section du cerveau avec la surface coronale coupée vers le haut vers l’expérimentateur.
8. Pour disséquer la SVZ, retirez le septum à l’aide d’une pince fine incurvée, puis insérez l’une des extrémités d’une pince fine dans le striatum immédiatement adjacent au ventricule et détachez la SVZ des tissus environnants. Placez la SVZ disséquée dans une boîte de Pétri contenant 1 ml de glucose PBS-0,6 %.

3. Dissociation tissulaire SVZ

1. Émincez la SVZ disséquée dans la boîte de Pétri jusqu’à ce qu’il n’en reste plus de gros morceaux.
2. Transvaser le tissu haché avec le glucose PBS-0,6 % dans un tube de 15 ml et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
3. Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de papaïne préchauffée (1 mg/ml, préparée à l’étape 1.4) complétée par 0,01 mg/ml de DNase I. Incuber pendant 10 min dans un bain-marie à 37 °C. Utiliser 1 ml de papaïne par souris.
4. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et jeter le surnageant.
5. Ajouter 1 ml d’ovomucoïde préchauffé (0,7 mg/ml, préparé à l’étape 1.5) pour arrêter l’activité de la papaïne. Dissociez mécaniquement le tissu haché en une suspension unicellulaire en pipetant doucement de haut en bas 20 fois à travers une pointe de micropipette p1000. Évitez les bulles d’air.
6. Passez la suspension cellulaire à travers un filtre stérile de 20 μm dans un tube neuf de 15 ml. Assurez-vous de laver le filtre à cellules avec du PBS 0,15 % BSA pour éviter de perdre des cellules.
7. Centrifuger à 200 x g pendant 10 min et jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 100 μl de PBS contenant 0,15 % de BSA.

4. Coloration immunofluorescente pour le tri cellulaire

Pour le tri cellulaire à l’aide de souris FUCCI-Red (Figure 1A), utilisez les anticorps suivants : conjugué phycoérythrine-cyanine7 CD24 [PC7] ; Ligand EGF conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine CD15/LeX [FITC] et à l’EGF conjugué à Ax647.

Remarque : cellules LeX⁺EGFR⁺ cellules et EGFR⁺ cellules ne sont pas abondantes dans la SVZ adulte : ≈ 600 et 1500 cellules/souris, respectivement. Nous recommandons de regrouper les cellules SVZ de 2 à 3 souris pour avoir suffisamment de matériel. Ne travaillez pas avec plus de 12 souris le même jour afin que la durée du tri cellulaire ne dépasse pas 3 heures. Gardez à l’esprit que travailler avec trop de souris le même jour entraînera une augmentation de la durée du tri cellulaire, ce qui peut entraîner une augmentation de la mort cellulaire et/ou de la différenciation cellulaire.

1. Réaliser la coloration FACS dans 100 μl de PBS 0,15 % BSA par souris (ou en 200 μl pour un groupe de 2 à 3 souris pour une coloration optimale).
2. Préparez les tubes de contrôle. Utilisez des billes de compensation pour préparer des tubes de contrôle d’une seule couleur selon le protocole du fabricant. Sélectionnez une fraction de cellules (1/10 des cellules extraites d’une souris suffit) et séparez-la dans 4 tubes pour préparer 1 tube de contrôle négatif (cellules non marquées) et 3 tubes de contrôle de fluorescence moins un (FMO). Remettre les cellules en suspension dans 200 μl de PBS 0,15 % BSA par tube.
   Astuce : Pour le contrôle LeX-FITC FMO, étiquetez les cellules avec le ligand EGF conjugué CD24-PC7 (1:50) et Ax647 (1:200) ; pour le contrôle FMO CD24-PC7, étiquetez les cellules avec CD15/LeX-FITC (1:50) et ligand EGF conjugué Ax647 (1:200) et pour le ligand EGF conjugué Ax647, étiquetez les cellules avec CD15/LeX-FITC (1:50) et CD24-PC7 (1:50).
3. Pour les tubes utilisés pour le tri cellulaire, utilisez les anticorps suivants à la dilution indiquée dans le PBS 0,15 % BSA : CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) et ligand EGF conjugué à Ax647 (1:200).
4. Incuber pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité. Laver avec 1 ml de PBS 0,15 % BSA et centrifuger à 200 x g pendant 10 min. Remettre les cellules en suspension dans 200 μl de PBS 0,15 % BSA par cerveau. Gardez les tubes de tri des cellules sur de la glace et procédez immédiatement au tri des cellules.
5. Si vous utilisez des souris FUCCI-Green, séparez les fractions LeX-positives et LeX-négatives à l’aide de colonnes de séparation avant le tri des cellules, car l’anticorps LeX-FITC partage la même longueur d’onde d’émission que la fluorescence FUCCI-green (Figure 2A, B).
   1. Tout d’abord, étiquetez les cellules avec un anticorps LeX anti-humain de souris (1:50) pendant 15 minutes à 4 °C dans l’obscurité dans 100 μl de PBS 0,15 % BSA.
   2. Laver les cellules avec 1 ml de PBS 0,15 % BSA et les centrifuger à 200 x g pendant 10 min, puis étiqueter les cellules avec des microbilles IgM anti-souris (1:10) pendant 15 minutes à 4 °C dans l’obscurité.
   3. Laver les cellules avec 1 ml de PBS 0,15 % BSA et centrifuger à 200 x g pendant 10 min. Remettez les cellules en suspension dans 500 μl de PBS 0,15 % BSA et versez les cellules à travers la colonne de séparation dans le champ magnétique comme schématisé dans Figure 2C. Laver la colonne avec 1 ml de PBS 0,15 % BSA pour obtenir une fraction négative LeX.
   4. Pour obtenir une fraction LeX-positive, retirez la colonne de séparation du champ magnétique et éluez les cellules avec 2 ml de PBS 0,15 % BSA.
   5. Passer à la coloration du ligand EGF conjugué CD24-PC7 et Ax647 comme indiqué en 4.2.

5. Tri des cellules

Note : Les cellules ont été triées sur un trieur FACS à 40 Psi avec une buse de 86 μm. La fluorescence a été collectée à l’aide du jeu de filtres suivant : 520/35 nm (FITC), 575/26 nm (PE), 670/20 nm (Ax647) et 740LP (PC7). Une compensation est nécessaire pour éviter les signaux faussement positifs car un chevauchement est constaté entre les spectres d’émission de la fluorescence FUCCI-rouge et du colorant PC7.

1. Immédiatement avant le tri cellulaire, ajoutez un colorant vital pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Nous avons utilisé Hoechst (HO) (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 2 μg/ml. Faites passer le tube de contrôle négatif (cellules non marquées) dans le trieur FACS et sélectionnez les cellules à l’aide des paramètres de diffusion latérale (SSC) et de diffusion directe (FSC) (Figure 3A).
   REMARQUE : Les cellules mortes ont été exclues en bloquant uniquement la fraction HO-négative (Figure 3A), puis les doublets ont été exclus en sélectionnant la fraction négative de largeur d’impulsion (Figure 3A).
2. Exécutez les commandes monochromes préparées à l’étape 4.2 et ajustez les tensions du tube photomultiplicateur (PMT) si nécessaire (c’est-à-dire une population négative trop élevée et/ou des cellules positives hors échelle). Effectuez la compensation des couleurs dans la fenêtre de compensation du logiciel.
3. Exécutez les contrôles FMO préparés à l’étape 4.2 (contrôle LeX-FITC FMO, contrôle FMO CD24-PC7 et contrôle FMO ligand EGF conjugué Ax647) et dessinez les portes de tri (Figure 3). Triez les cellules directement dans 100 μl de milieu de culture dans des microtubes de 1,5 ml.

6. Préparation des cellules pour la microscopie

1. Plaquez les cellules fraîchement triées à une densité de 1 - 3 x 10³ cellules/puits sur une plaque μ à 96 puits recouverte de poly-D-Lysine avec 300 μl de milieu de culture.
2. Avant la microscopie vidéo, incuber les plaques de culture à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant au moins 1 heure pour permettre l’adhésion cellulaire.

7. Configuration du microscope et acquisition d’images

1. Effectuez une imagerie en direct à l’aide d’un objectif Plan Apo VC 20x DIC (NA : 0,75) sur un système de microscope confocal à balayage laser fixé à une chambre thermostatée inversée à 37 °C sous une atmosphère de CO₂ à 5 %.
2. Placez la plaque μ à 96 puits à l’intérieur de la chambre thermostatée préchauffée et équilibrée et remplacez le couvercle par un couvercle thermostaté.
3. Ouvrez le logiciel NIS-Elements et cliquez dans la barre de menu sur « Acquisition/Commandes d’acquisition/Acquisition ND » pour sélectionner les options du time-lapse (longueur, positions de la platine, sections z confocales,...), « Acquisition/Commandes d’acquisition/Ti Pad » pour sélectionner les objectifs et « Acquisition/Commandes d’acquisition/Paramètres A1plus » pour sélectionner le niveau PMT pour chaque fluorescence dans la barre de menus. Sélectionnez un dossier pour enregistrer les fichiers de données.
4. À l’aide de la fenêtre d’acquisition ND, définissez le centre de chaque puits comme position de platine et sélectionnez l’option grande image sur 7 x 7 mm². Cela créera une image en mosaïque autour du centre de chaque puits. Définissez le chevauchement de la grande image mosaïque sur 5 %. Prenez des photos toutes les 20 minutes pendant 24 heures. Sélectionnez l’objectif Plan Apo VC 20x DIC (NA : 0,75) dans la fenêtre Ti Pad.
5. Dans la fenêtre Paramètres A1plus, acquérez des images à l’aide d’un scanner résonant haute vitesse au format 512 x 512 pixels avec une résolution de 1,26 μm/pixel. Utilisez le fond clair pour visualiser les formes des cellules. Dans le cas des souris FUCCI-Red, excitez la fluorescence rouge à 561 nm et collectez à l’aide d’un filtre 595/50 nm. Dans le cas des souris FUCCI-Green, excitez la fluorescence verte à 488 nm et collectez à l’aide d’un filtre 530/40 nm. Déterminez le niveau PMT optimal, le décalage et la puissance laser pour chaque longueur d’onde.
   REMARQUE : Nous vous recommandons d’utiliser la fonction de mise au point automatique pour le canal fond clair afin de permettre au logiciel de faire la mise au point automatique à chaque position de scène avant chaque acquisition. Astuce : Un objectif Plan Apo VC 20x DIC (NA : 0,75) a été utilisé pour son excellente résolution sans avoir besoin d’huile. D’autres objectifs peuvent être utilisés en fonction de la résolution optique souhaitée.
6. Sélectionnez le bouton « Exécuter maintenant » dans la fenêtre d’acquisition ND pour commencer l’acquisition.

Résultats

Figure 1 : Analyses en direct du cycle cellulaire à l’aide de souris FUCCI-Red. (A) Représentation schématique du cycle de cellules FUCCI-Red, où les cellules sont fluorescentes en rouge pendant le G₁ phase et incolore p...

Matériaux