Imagerie en accéléré de la division de cellules souches neurales de souris à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Source : Daynac, M., et. al. Tri cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices de la zone subventriculaire de la souris adulte et imagerie en direct de la dynamique de leur cycle cellulaire. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre l’imagerie en accéléré de cellules souches neurales (NSC) à partir du cerveau d’une souris transgénique à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Les NSC deviennent fluorescentes en rouge pendant la phase G1 et ne sont pas fluorescentes dans les autres phases du cycle cellulaire. Une culture NSC collée est placée dans la chambre d’imagerie, les paramètres d’imagerie sont définis et les images sont capturées à intervalles réguliers pendant la durée souhaitée.

Protocole

1. Configuration de base avant la culture et la vidéomicroscopie

1. Utilisez des plaques de culture à fond de verre ou des plaques μ pour la vidéomicroscopie confocale. Pour 1 à 5 x 10³ cellules/puits, utilisez des plaques à 96 puits, et pour plus de 5 x 10³ cellules/puits, utilisez des plaques à 24 puits.
2. Au moins un jour avant le début de l’expérience, préparer des plaques stériles revêtues de poly-D-lysine (PDL) pour les cultures monocouches adhérentes. Ajouter suffisamment de PDL (10 μg/ml dans de l’eau distillée ou dH₂O) pour enrober le fond de chaque puits et incuber toute la nuit (O/N) à 37 °C. Retirer la solution ....

Résultats

Figure 1 : Analyses en direct du cycle cellulaire à l’aide de souris FUCCI-Red. (A) Représentation schématique du cycle de cellules FUCCI-Red, où les cellules sont fluorescentes en rouge pendant le G₁ phase et incolore p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
96-plaques de culture à fond de verre non revêtues	MatTek Corp.	P96G-1.5-5-F
μ-Plaques 96-puits	Ibidi	89626
Poly-D-Lysine	Millipore	A003E
NeuroCult NSC Basal Medium	STEMCELL Technologies	5700
NeuroCult NSC Supplément de prolifération	STEMCELL Technologies	5701
Héparine	STEMCELL Technologies	7980
EGF	Millipore	GF144
FGF-2	Millipore	GF003
Papain	Worthington	LS003119
EBSS	Invitrogen	24010-043
L-cystéine	Sigma	C-7352
0.5M EDTA, pH 8.0	Promega	V4231
DNase I	Sigma	D5025-15KU
Inhibiteur de la trypsine type II	Sigma	T9128	Ovomucoïde
DMEM :F12 medium	Life Technologies	31330-038
Filtre 20 μm	BD Medimachine Filcon	340622
Eppendorf microtubes 3810X	Sigma	Z606340-1000EA
BSA	Sigma	A1595	d’albumine sérique bovine
CD24 conjuguée phycoérythrine-cyanine7 [PC7]	Life Technologies	A14776	IgM de souris ; clone MMA. 1:50
CD15/LeX isothiocyanate de fluorescéine [FITC] - conjugué	BD Biosciences	332778	Rat IgG2b ; clone M1/69. 1:50
Anticorps LeX anti-humain de souris	BD Pharmingen	559045	IgM de souris ; clone MAM. 1:50
Alexa647 - ligand EGF conjugué	Life Technologies	E35351	1:200 ; Ligand EGF conjugué Ax647
CompBeads	BD Biosciences	644204
MACS LS Colonnes de séparation	Miltenyi Biotec	130-042-401	Colonnes de séparation
Microbilles IgM anti-souris	Miltenyi Biotec	130-047-301
Hoechst 33258	Sigma	861405
Trieur de cellules INFLUX	BD Biosciences		Trieur FACS
Système de microscope confocal à balayage laser Nikon A1R fixé à un ECLIPSE Ti inversé	Nikon Corp.		Microscope confocal à balayage laser
NIS-Elements AR.4.13.01 Logiciel 64 bits	Nikon Corp.		Logiciel NIS-Elements Objectif
DIC Plan Apo VC 20x (NA : 0,75)	Nikon Corp.
Chambre thermostatée ECLIPSE Ti	Nikon Corp.		Chambre thermostatée
ImageJ	RBS
FlowJo	Tree Star, Ashland, OR
souris FUCCI	RIKEN BioResource Center, JAPON

Solution