Isolement et caractérisation de Hoechst Faible CD45 Négatifs Souris Cellules souches mésenchymateuses du poumon

Summary

Dans cet article, nous démontrons l'isolement des souris des cellules pulmonaires souches résidentes mésenchymateuses (CSM poumons), leur expansion, la caractérisation et l'analyse des propriétés immunomodulatrices.

Abstract

Tissu cellules résidentes souches mésenchymateuses (CSM) sont des régulateurs importants de réparation ou de régénération tissulaire, la fibrose, l'inflammation, l'angiogenèse et la formation de tumeurs. Prises ensemble, ces études suggèrent que les MSC pulmonaires résidents jouent un rôle lors de l'homéostasie tissulaire pulmonaire, une lésion et de réparation au cours des maladies comme la fibrose pulmonaire (PF) et l'hypertension artérielle (HPA). Nous décrivons ici une technologie de définir une population de MSC poumon résident. La définition de cette population dans le tissu pulmonaire in vivo utilisant un ensemble de marqueurs définissent facilite l'isolement répété d'une population de cellules souches bien caractérisées par cytométrie en flux et l'étude d'un type cellulaire et la fonction spécifiques.

Protocol

1. Isolement du poumon

1. Sacrifice souris adultes (8-10 semaines d'âge; 18-20 g; C57Bl6J) des souris avec une surdose d'isoflurane suivi par exsanguination utilisant une technique stérile. Profils varient légèrement entre les souches.
2. Enlever chirurgicalement le diaphragme, d'ouvrir la cavité thoracique en coupant la cage thoracique latéralement de chaque côté de la souris. Rincer le sang des poumons en perfusant le ventricule droit du cœur doucement à l'aide de 3 5 ml de tampon phosphate salin (PBS).
3. Disséquer les lobes pulmonaires enlever la trachée les bronches et les grands et les placer dans une boîte de Pétri remplies de solution saline tamponnée de Hanks (HBSS). Après la collecte des lobes pulmonaires tous les forceps sont utilisés pour placer le tissu sur le couvercle du plat. Tissu est ensuite hachée en petits morceaux à l'aide de scalpels jetables avec assez de liquide pour les garder humides, mais pas tant qu'elles flottent et se déplacent.
4. Disséquer une patte arrière d'une des souris et d'isoler la moelle osseuse pour l'utiliser comme un contrôle pour régler la coloration flow cytométrie portes. Tache de la moelle osseuse (BM), comme décrit précédemment ^1.

2. Préparation d'une suspension cellulaire unique des tissus pulmonaires

1. Chaque poumon est digérée en utilisant un poids optimisé pour les tissus rapport en volume de 0,2 g: 5 ml de pré-chauffé à 0,2% Worthington type 2 collagénase (Biochemicals Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissous dans du HBSS stérile. Le mélange est immergé dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 min ^2,3.
2. Triturer échantillon bien digérer jusqu'au tissu pulmonaire s'écoule facilement par une pipette de 10ml (environ 10 répétitions). Incuber pendant 15 min supplémentaires à 37 ° C pour compléter le tissu digère et assure une suspension cellulaire plus uniforme unique.
3. Diluer la suspension de cellules de poumon avec HBSS et triturer avec une pipette de 5 ml pour disperser des fragments de tissu résiduel.
4. Filtrer la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire pour enlever 70μM fragments de tissus non digérés. L'échantillon peut être divisé en multipltubes coniques e à ce point pour éviter la surcharge des cellules et une crépine de diminuer le temps.
5. Pellet la suspension cellulaire pendant 10 min à 1500 rpm et décanter le surnageant.
6. Resuspendre le culot cellulaire en douceur en utilisant la température ambiante RBC tampon de lyse (eBiosciences, San Diego, CA; # cat 00-4333-57) et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter un volume égal de HBSS pour inactiver le tampon de lyse et de filtrage de la suspension cellulaire à l'aide d'une passoire cellules 40μM pour enlever les débris et les agrégats cellulaires.
7. Pipeter 10 ul de chaque échantillon à être colorées et de compter le nombre de cellules à la fois pour le poumon et les échantillons de BM en utilisant un hématimètre. Remarque: enregistrer le volume total des cellules.
8. Pellet la suspension cellulaire unique de cellules pulmonaires par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min.
9. Resuspendre deux poumons et les cellules BM au 1x10 ⁶ cellules / ml dans préchauffé (37 ° C) DMEM + (milieu de Dulbecco modifié Eagle, élevée en glucose (Gibco, Carlsbad, CA; # cat 11965-092) contenant 2% de fœtus BoviNE sérum (FBS) et HEPES 10 mM.
10. Préparer une solution stock de 1mg/ml de Hoechst 33342 colorant (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; # cat B2261) dans l'eau et stériliser par filtration ^1,4. Le colorant Hoechst peuvent être stockées sous forme d'aliquots à -80 ° C.
11. Ajouter Hoescht 33342 teinture à une concentration finale de 5μg/ml (une dilution 200x d'un stock 1mg/ml) à la suspension cellulaire unique.
12. Mélanger délicatement les cellules par l'inversion et incuber à 37 ° C l'eau de bain pour exactement 90 minutes.

3. Coloration et préparation de la suspension cellulaire du poumon pour l'analyse de cytométrie en flux

1. Après 90 minutes toutes les étapes avec les cellules des poumons tachés Hoechst doit être exécuté à 4 ° C ou sur la glace pour empêcher l'efflux de teinture. Pellet les cellules par centrifugation à 1500 rpm pendant 10 min à 4 ° C et remettre en suspension les cellules dans tampon glacé coloration (PBS 2% de FBS).
2. Resuspendre les cellules à une concentration ne dépassant pas 1x10 ⁷ cellules / tube à l'
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Discussion

Nous avons adapté une méthode initialement utilisée pour identifier BM cellules hématopoïétiques à isoler une population spécifique de MSC poumon résident. En raison de la reproductibilité de l'isolement de ces cellules ont ensuite été bien caractérisés comme MSC. Leur origine a été définie en tant que résident dans les poumons de souris adulte (par opposition aux dérivés BM) et un profil phénotypique et moléculaire documentée ^2. La capacité d'isoler plusieurs reprises cette population caractérisée permet une étude plus approfondie de l'importance biologique et le rôle du CSM du poumon au cours homéostasie tissulaire et la maladie. La définition récente de cette population in vivo dans les tissus pulmonaires à la fois humain et murin facilite le développement d'une stratégie thérapeutique visant à la rescousse des cellules endogènes pour faciliter la réparation du poumon au cours blessures et des maladies.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Tampon phosphate salin (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks solution saline tamponnée (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% de type 2 Worthington collagénase	Biochimiques Worthington	LS004202
Rouge tampon de lyse des globules	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Hoechst 33342 colorant	Sigma	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
L'iodure de propidium	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% de trypsine / EDTA	Cellgro	25-053-Cl
Medium MesenCult complète	Stem Cell Technologies	05511
0,4% p / v de solution de coloration de Giemsa	Sigma	GS1L
Paraformaldéhyde à 4%	Services de microscopie électronique	15710	Paraformeldehyde 16% est dilué à 4% en utilisant PBS
Carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)	Sigma	21888