Visualisation du plexus choroïde du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Résumé

Source : Van Wonterghem, E., et al. Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière, visualisation du plexus choroïde de souris. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie du tissu du plexus choroïde à partir du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB). Le processus comprend la fixation des tissus, la déshydratation et l’enrobage d’une couche de platine conductrice pour stabiliser et préparer l’échantillon pour l’imagerie. Le MEB capture des images détaillées des cellules épithéliales avec des microvillosités, ce qui donne un aperçu des caractéristiques structurelles du tissu.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Analyse morphologique du tissu du plexus choroïde (PC) à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB)

ATTENTION : Des solutions toxiques sont utilisées dans les étapes de traitement suivantes. Il est recommandé d’effectuer la préparation de l’échantillon dans une hotte.

1. Effectuez la préparation des échantillons pour le MEB comme décrit ci-dessous.
   1. Transvaser la PC fraîche isolée dans une solution de fixation fraîchement préparée contenant 2 % de paraformaldéhyde et 2,5 % de glutaraldéhyde dans un tampon de na-cacodylate 0,1 M (pH 7,4). Incuber toute la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Comme le tissu CP est très fragile et fin, il faut le placer dans de petits paniers à échantillons (voir Table des matériaux) pour le transférer entre les tampons. De cette façon, la structure du tissu sera mieux préservée. Un fixateur à base de cacodylate est utilisé par rapport à un fixateur à base de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), car le tampon cacodylate puissant peut contrer le faible pH du glutaraldéhyde dans le fixateur EM.
   2. Lavez l’échantillon 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 3 à 5 ml de tampon Na-cacodylate 0,1 M (pH 7,4).
   3. Fixer les échantillons dans 3 à 5 mL de tétroxyde d’osmium à 2 % dans un tampon de cacodylate de na à 0,1 M pendant 30 min. Lavez les échantillons 3 fois pendant 5 minutes chacune avec 3 à 5 ml d’eau ultrapure.
   4. Déshydrater les échantillons dans une série de solutions glacées de concentrations croissantes d’éthanol (EtOH) (50 %, 70 %, 85 %, 100 %), pendant 15 min par solution d’EtOH. Utilisez un sécheur à point critique pour sécher correctement l’échantillon. REMARQUE : Le passage de la phase liquide à la phase gazeuse affecte la tension superficielle, causant des dommages à la structure de surface. L’étape de séchage au point critique permet de préserver la structure de la surface.
   5. Positionnez soigneusement l’échantillon sur un support d’échantillon muni d’un autocollant carbone (voir Tableau des matériaux).
   6. Enduisez les échantillons d’une fine couche (2-5 nm) de platine. Pour ce faire, montez une source de platine dans un système de vide entre deux bornes électriques à courant élevé et chauffez le platine à sa température d’évaporation. Un fin filet de platine se dépose sur l’échantillon. NOTE : Outre le platine, l’or ou l’or/palladium peuvent également être utilisés.
2. Visualisez les échantillons de CP avec MEB (voir Table des matériaux). La procédure de visualisation des tissus CP via SEM est similaire à celle des autres types de tissus et dépend du logiciel et des instruments utilisés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supports d’échantillons en aluminium	EM Sciences	75220
Tampon cacodylate	EM Sciences	11652
Languettes adhésives en carbone -12 mm	EM Sciences	77825-12
Sécheur point critique	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		SEM system
Forceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldehyde	EM Sciences	16220
Osmium Tetroxide	EM Sciences	19170
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS sans Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ ou rouge de phénol ; filtré stérile
Panier à échantillons en acier inoxydable	EM Sciences	70190-01