Imagerie par fluorescence de la dynamique calcique synaptique dans un modèle in vitro de sclérose latérale amyotrophique

Résumé

Source : Krishnamurthy, K. et al. Mesure fluorescente en temps réel des fonctions synaptiques dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo présente l’imagerie calcique en temps réel pour surveiller l’activité synaptique dans les neurones mutants de la SLA exprimant un biocapteur calcique génétiquement codé. Il décrit les étapes de préparation des neurones pour l’imagerie, la stimulation de la dynamique calcique et l’enregistrement de la fluorescence pour mesurer les changements en temps réel des niveaux de calcium intracellulaire, qui reflètent l’activité synaptique neuronale.

Protocole

1. Imagerie par fluorescence des transitoires calciques de Gcamp6m

1. Transfect Neurones corticaux primaires de rongeurs cultivés sur des boîtes à fond de verre de 35 mm avec 500 ng de Gcamp6m.
   REMARQUE : Si vous le souhaitez, co-transfectez les neurones avec un plasmide d’intérêt contenant une étiquette fluorescente dans la gamme rouge ou rouge lointain.
2. Incuber des neurones avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (LCa) à faible teneur en chlorure de potassium (KCl) (tableau 1) pendant 15 min, 48 h après la transfection, puis monter la parabole sur la plate-forme d’imagerie.
3. Visualisez la fluorescence du GCaMP6m à l’aide d’un filtre à isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (488 nm) et d’un objectif 20x ou 40x.
4. Sélectionnez le champ d’imagerie et engagez une mise au point parfaite. Ensuite, prenez une seule image fixe avec des canaux de marquage en fond clair, FITC et de fluorescence pour marquer les limites neuronales.
5. Lancez Run Now dans le logiciel d’acquisition. Effectuer l’enregistrement de référence pendant 5 min, puis perfuser avec un LCR contenant 50 mM de KCL (Tableau 1).
   REMARQUE : L’objectif de cette imagerie est de mesurer les transitoires calciques évoqués. Si un neurone a une activité de décharge basale et des flux de calcium pendant la période de pré-stimulation, il n’est pas utilisé dans l’analyse des données. Au lieu de cela, seules des cellules avec une fluorescence de fond stable sont utilisées. Les périodes de post-stimulation peuvent également être prolongées à 60 min pour les transitoires calciques, avec ou sans perfusion continue supplémentaire de KCl élevé.
6. Enregistrez l’expérience et analysez les données à l’aide d’un logiciel confocal. L’expérience peut être arrêtée à ce stade, et l’analyse peut être effectuée plus tard.
   REMARQUE : Si les cellules n’ont pas besoin de transfection pour l’expression des protéines d’intérêt, ce protocole peut être réalisé à tout moment in vitro lorsqu’on cherche à examiner les transitoires calciques. Après un test sur des cellules témoins pour s’assurer de la mesure des transitoires calciques, l’expérimentateur doit être insuté des conditions génétiques ou pharmacologiques de chaque boîte testée afin de minimiser les biais.

2. Analyse d’images

1. Ouvrez des images en accéléré avec un logiciel confocal.
2. Alignez les images dans des séries time-lapse à l’aide de la commande series : Image | Traitement | Aligner le document actuel. Sélectionnez Aligner sur le premier cadre.
3. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROI) le long des neurites à l’aide de l’outil de sélection de ROI, une icône en forme de haricot à droite du cadre de l’image. Marquez également un retour d’intérêt représentant l’intensité de la fluorescence de fond.
   REMARQUE : Les points d’intérêt sont sélectionnés en choisissant des zones de points nettement séparés le long des pistes neuronales indiquées par l’image fixe en fond clair. Au moins cinq ROI par neurone sont choisis pour l’analyse. Le retour sur investissement de l’arrière-plan est choisi dans une région du champ de vision qui ne contient pas de neurites.
4. Mesurez la fluorescence brute au fil du temps pour les zones d’intérêt sélectionnées à l’aide de la série de commandes suivante : Mesurer | Mesure du temps.
   1. Lance la fonction Mesure dans la partie supérieure du panneau Mesure du temps. Une représentation graphique de la fluorescence brute au fil du temps et des données quantitatives sont générées.
      REMARQUE : Chaque point de données représente la fluorescence brute pour ce retour sur investissement pour l’image associée à ce point de temps mesuré spécifique.
5. Exportez les intensités de fluorescence brutes vers le tableur.

Tableau 1 : Composition des tampons de liquide céphalo-rachidien artificiel (LCR-A).

Low KCL aCSF buffer (pH 7.40 à 7.45)
Concentration	réactif
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glucose	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1
mM Tampon KCL aCSF élevé (pH 7,40 à 7,45)
Concentration du réactif
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50
mM Glucose	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

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Matériaux