Microscopie holographique à deux photons pour étudier l’activité neuronale et la connectivité dans un modèle murin

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation de la plaque céphalique (Figure 1A)

1. Administrez l’anesthésique (un mélange de 74 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine) par voie intrapéritonéale pour anesthésier la souris. Vérifiez fréquemment l’état anesthésique de la souris en évaluant les réflexes de la pédale.
2. Après l’anesthésie, placez la souris dans un instrument stéréotaxique. Appliquez une pommade oculaire (voir tableau des matériaux) pour éviter que la cornée ne se dessèche lors de l’implantation de la plaque de tête.
3. Rasez la zone chirurgicale et désinfectez la peau avec trois cycles alternés de gommages à la povidone iodée ou à la chlorhexidine suivis de lingettes alcoolisées à 70 %. Exposez soigneusement le crâne et nettoyez-le avec des cotons-tiges.
   REMARQUE : Tous les instruments chirurgicaux doivent être stérilisés et toutes les procédures doivent être effectuées en conséquence. Tous les débris restants (par exemple, des cheveux ou du sang séché) provoquent des réactions inflammatoires. Par conséquent, tous les débris doivent être enlevés sous un stéréoscope à l’aide de cotons-tiges imbibés d’eau stérile ou d’alcool à 70 %.
4. Utilisez les coordonnées stéréotaxiques - antérieure et postérieure = 0,5 mm, médiale et latérale = 1,5 mm du bregma - pour trouver le centre de la craniotomie et l’étiqueter avec un marqueur.
5. Placez une plaque de tête sur mesure au centre du crâne. Ensuite, appliquez du ciment dentaire (voir Tableau des matériaux) pour le fixer fermement au crâne. Appliquez une légère pression jusqu’à ce que la plaque cintrée entre en contact ferme avec l’avant et l’arrière du crâne.
   REMARQUE : Cette étape dure environ 20 minutes et est essentielle pour réduire les artefacts de mouvement dans le cerveau lors de l’imagerie à deux photons. Les dimensions de la plaque de tête sont de 20 mm × 40 mm × 1 mm avec une ouverture en forme de plaque d’accueil avec un bord de 15 mm de long, deux côtés adjacents de 3 mm de long et les deux côtés restants de 10 mm de long.
6. Mélangez un ciment résine adhésif dentaire à base d’acrylique comme suit : une demi-cuillère de poudre, trois gouttes de liquide et une goutte de catalyseur (voir le tableau des matériaux). Pour éviter le dessèchement, appliquez ce ciment résine adhésif dentaire mixte sur la surface intacte du crâne de la souris avec la plaque de tête.
7. Placez la souris dans une cage chaude jusqu’à ce qu’elle se soit remise de l’anesthésie. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.

2. Chirurgie et injection de virus adéno-associé (AAV) (Figure 1B)

1. Effectuez une craniotomie ou une injection virale sans retirer le ciment de résine adhésive dentaire du crâne 1 jour après l’implantation de la plaque de tête.
   REMARQUE : Administrez une anesthésie (un mélange de 74 mg/kg de kétamine et de 10 mg/kg de xylazine) par voie intrapéritonéale à la souris pendant cette procédure.
2. Pour éviter l’œdème cérébral, administrer du phosphate de sodium de dexaméthasone (1,32 mg/kg) par voie intrapéritonéale 1 h avant l’intervention.
3. Anesthésie la souris avec la plaque de tête avec une anesthésie à 1 % d’isoflurane à l’aide d’un vaporisateur (système d’administration d’anesthésie) tout en maintenant la température corporelle avec un coussin chauffant. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir le dessèchement de la cornée.
4. Sous un stéréoscope, effectuez une craniotomie circulaire d’environ 2 mm de diamètre à l’aide d’une perceuse dentaire. Pour réduire les lésions cérébrales, utilisez la fraise dentaire avec précaution avec un léger mouvement constant et une légère pression vers le bas.
5. Prélever plusieurs fois les fragments d’os à l’aide d’un système d’aspiration. Après avoir retiré les fragments d’os, utilisez une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour enlever et laver tous les débris restants à la surface du cerveau. Répétez cette procédure de nettoyage plusieurs fois pour supprimer les réactions inflammatoires.
   REMARQUE : La solution ACSF (140 mM de chlorure de sodium, NaCl, 2,5 mM de chlorure de potassium, KCl, 5 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique, HEPES, 2,0 mM de chlorure de calcium, CaCl₂, et 1,0 mM de chlorure de magnésium, MgCl₂) a été stockée à 4 °C pendant 1 mois après la dissolution et la filtration du réactif (taille des pores = 0,22 μm).
6. À l’aide d’un système d’injection sous pression (voir le tableau des matériaux), réglez la pression appropriée (environ 10 livres par pouce carré (PSI) en impulsions d’une durée de 4 ms) pour injecter 500 nL de solution AAV à travers un capillaire en verre d’un diamètre de pointe de 10 à 20 μm (préparé avec un extracteur de micropipette) pendant 10 min.
7. Déterminez si la solution AAV est administrée au cerveau en vérifiant si le niveau de la solution AAV dans le capillaire en verre diminue progressivement.
8. Laissez le capillaire en verre en place pendant 10 minutes supplémentaires pour éviter le reflux. Répétez l’opération trois fois pour administrer un total de 1,5 μL de solution d’AAV dans le cerveau.
9. Pour évaluer et manipuler l’activité neuronale dans les cellules pyramidales de couche 2/3 (L2/3), injecter une solution AAV (pour l’imagerie Ca²⁺ : AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE à 1,28 ×^{10 14} génomes vectoriels/mL, dilué 1:1 dans une solution saline ; pour l’imagerie Ca²⁺ avec l’optogénétique : AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE à 1,73 × 10¹⁴ génomes vectoriels/mL, dilués 1:1 dans une solution saline) dans la zone de la patte postérieure du cortex somatosensoriel primaire des souris de type sauvage (S1, centré à 0,5 mm en arrière et à 1,5 mm latéralement de la bregma, à 150 μm de profondeur de la surface).
   REMARQUE : La solution AAV doit être injectée à 2-3 semaines et 1-2 semaines avant l’imagerie pour l’expression de jGCaMP8f et GCaMP6m-P2A-ChRmine, respectivement.
10. Après une application de 2 % (p/v) d’agarose à bas point de fusion sur la surface du cerveau de S1 à l’aide d’une micropipette, placez une fenêtre en verre sur la craniotomie avec deux verres de couverture. Fixez les deux verres de protection (petit diamètre 2,0 mm et grand diamètre 4,5 mm ; voir tableau des matériaux) avec un adhésif durcissable aux rayons ultraviolets (UV).
11. Appuyez le verre de protection contre l’agarose pendant qu’il est encore liquide, ce qui empêche la formation de bulles d’air dans l’agarose. Scellez les bords de la fenêtre crânienne avec de la résine de ciment dentaire et adhésive (figure 1C).
12. Retirez la souris de l’instrument stéréotaxique et remettez-la dans sa cage. Placez la souris dans une cage chaude et ne retournez pas dans la cage avec d’autres animaux tant qu’elle n’est pas complètement rétablie de l’anesthésie. Maintenir soigneusement des conditions stériles pendant la chirurgie de survie.
13. Pendant les 72 premières heures après la chirurgie, vérifiez l’état de santé de la souris en observant le comportement général. S’il y a des anomalies dans le comportement général, injectez par voie sous-cutanée des agents anti-inflammatoires et analgésiques.

3. Préparation pour le système de stimulation holographique ou d’éclairage (Figure 2)

1. Calibrez le système de stimulation holographique en plaçant la surface d’une lame de fluorescence rouge (substrat acrylique coulé) sur le plan de l’échantillon. Placez le microscope en mode d’imagerie en direct avec une lumière d’excitation faible et exécutez le fichier calibration_GUI.m. Vérifiez le volet des paramètres et cliquez sur le bouton Enregistrer.
2. Cliquez sur le bouton Z Scan dans le volet de l’étape 1. Il générera automatiquement trois points aléatoires dans les 21 plans axiaux, à 2 μm de chaque plan.
3. Déplacez la barre de défilement et vérifiez l’image en direct. Trouvez un plan parfait où les taches apparaissent les plus petites et les plus brillantes, puis cliquez sur le bouton Enregistrer. Cela générera automatiquement un front d’onde sphérique décalé pour l’hologramme numérique.
   REMARQUE : Si vous ne parvenez pas à trouver les points de fluorescence les plus brillants, modifiez les valeurs minimale et maximale de la plage de balayage et réessayez.
4. Cliquez sur le bouton Aller dans le volet de l’étape 2, puis cliquez à six endroits sur le carré de gauche. Vérifiez l’image en direct. S’il y a six points de fluorescence distincts, saisissez leurs axes x et y dans les zones d’édition et cliquez sur le bouton Enregistrer. Cela générera automatiquement des coefficients de transformation affine pour coordonner l’étalonnage entre la stimulation holographique et le système d’imagerie.
   REMARQUE : Le numéro de paire d’axes et le numéro de spot cliqué doivent correspondre dans l’ordre. Si vous n’êtes pas sûr, ou s’il n’y a pas de taches dans votre image, veuillez réessayer et générer un motif de taches unique ou choisir une plage plus petite autour du centre du champ de vision (FOV).
5. Cliquez sur le bouton Analyser dans le volet de l’étape 3. Il générera 441 hologrammes numériques pour effectuer un balayage ponctuel sur le champ de vision en 21 × 21 étapes.
   1. Tout d’abord, vérifiez les images tout en changeant les motifs dans la zone de liste. Ensuite, ajustez la puissance du laser pour obtenir des images ponctuelles dans la plage dynamique de l’appareil d’imagerie (par exemple, pour éviter les images trop saturées).
   2. Par la suite, ajustez la durée de l’intervalle dans la zone d’édition ; la durée de l’intervalle doit être supérieure à deux fois la durée de l’intervalle d’enregistrement. Enfin, mettez l’appareil d’imagerie en mode d’enregistrement et cliquez sur le bouton Lecture. Si le jeu se termine, les chaînes « display OK » s’afficheront dans la fenêtre de commande. Arrêtez l’enregistrement et empilez les images séquentielles enregistrées à l’aide de la méthode d’intensité maximale.
6. Cliquez sur Générer WM dans le volet de l’étape 4 et choisissez une image empilée ci-dessus. Fermez ensuite la fenêtre calibration_GUI. Il générera automatiquement une carte de poids pour compenser l’intensité déséquilibrée dans chaque spot.
   REMARQUE : Pour une description plus détaillée, le code MATLAB peut être téléchargé ici (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Imagerie Ca²⁺ à l’aide d’un capteur d’image avec éclairage holographique (Figure 3)

1. Placez la souris injectée d’AAV avec une plaque frontale sous le microscope (Figure 1D).
   REMARQUE : Au cours de cette procédure, la souris est immobilisée à l’état d’éveil, mais elle est capable d’échapper aux stimuli inconfortables.
2. Effectuez une imagerie à deux photons (mode de balayage ponctuel) à l’aide d’un microscope holographique et d’un laser Ti : saphir à verrouillage de mode réglé à 920 nm avec un objectif 25x (voir le tableau des matériaux).
3. Allumez le logiciel d’imagerie commercial (voir la Table des matériaux). En mode imagerie en direct, ajustez la tension du détecteur d’image (voir Tableau des matériaux) et la puissance du laser d’imagerie pour optimiser la luminosité des neurones exprimant jGCaMP8f. Capturer des images des neurones exprimant cette protéine.
   REMARQUE : L’intensité du laser d’imagerie (920 nm) est de 20-30 mW. Le champ de vision était de 512 μm × 512 μm à une profondeur de 100-150 μm de la surface corticale.
4. Pour éclairer des neurones spécifiques exprimant jGCaMP8f avec une illumination holographique, exécutez le fichier de script SLMcontrol.m. Cliquez sur l’image de référence et choisissez l’image acquise ci-dessus. Ensuite, cliquez sur le bouton Spot pour choisir des pixels spécifiques sur les neurones de l’image en cliquant continuellement avec la souris (Figure 3A). Si la sélection est terminée, appuyez sur le bouton Entrée du clavier pour la finaliser.
   REMARQUE : L’hologramme numérique est automatiquement calculé et affiché sur le modulateur spatial de lumière (SLM). Ce modèle peut également être revisité en cliquant sur une liste de liste. La résolution spatiale d’un seul point généré par le SLM était d’environ 1,2 μm le long de la direction transversale et de ~8,3 μm le long de l’axe optique. Nous avons utilisé un objectif à grande ouverture numérique (1,1) pour obtenir une stimulation holographique plus localisée.
5. Pour détecter l’activité neuronale avec une résolution temporelle élevée à l’aide d’un capteur d’image (voir le tableau des matériaux), réglez le temps d’exposition, la zone d’imagerie et le binning (Figure 3B) avant d’effectuer l’acquisition de l’image (Figure 3C).
   REMARQUE : L’intensité du laser d’éclairage holographique (920 nm) qui stimule en permanence un neurone est de 2 mW, ce qui est suffisant pour détecter l’activité neuronale. Par exemple, pour obtenir une fréquence d’images de 100 Hz pour l’imagerie, le temps d’exposition est de 9 ms, la zone d’imagerie est de 400 μm × 400 μm et le binning est de 4.
6. Après l’expérience, remettez la souris dans sa cage d’origine.

5. Imagerie à deux photons (mode de balayage ponctuel) avec optogénétique à l’aide d’un microscope holographique (Figure 4)

1. Répétez les étapes 4.1 et 4.2.
2. Allumez le logiciel d’imagerie commercial (voir la Table des matériaux). En mode d’imagerie en direct, ajustez la tension du détecteur d’image (voir Tableau des matériaux) et la puissance du laser d’imagerie pour optimiser la luminosité des neurones exprimant GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capturer des images des neurones exprimant ces protéines (Figure 1E).
3. Répétez l’étape 4.4.
4. Pour étudier la connectivité fonctionnelle au sein des neurones L2/3, utilisez un SLM pour générer des motifs holographiques de stimulation optogénétique (ChRmine ; 1 040 nm) et combinez-le avec l’imagerie à deux photons Ca²⁺ (GCaMP6m ; 920 nm, 512 × 512 pixels, 2 Hz ou 30 Hz, zoom numérique 2x, mode de balayage ponctuel ; Figure 3D-H).
   1. Pour ce protocole, réglez l’intensité du laser d’imagerie à 920 nm, à 10-20 mW, et le champ de vision à 256 μm × 256 μm mesuré à une profondeur de 100-150 μm de la surface corticale. Réglez le temps de séjour des pixels à 1,5 μs pour 2 Hz ou 100 ns pour 30 Hz.
   2. Pour voir si un seul stimulus holographique a provoqué une réponse calcique dans les neurones, utilisez à la fois 2 Hz et 30 Hz comme fréquence d’images d’imagerie. Réglez l’intensité du laser de stimulation holographique (1 040 nm) qui stimule un seul neurone à 10 mW, ce qui est suffisant pour induire une activité neuronale (Figure 3D).
      REMARQUE : La résolution spatiale d’un seul point généré par le SLM est d’environ 1,2 μm le long de la direction transversale et de ~8,3 μm le long de l’axe optique. La plage de volume accessible dans le sens latéral est d’environ 500 μm × 500 μm et 100 μm dans le sens axial. Nous avons en outre confirmé avec l’imagerie Ca²⁺ à une fréquence d’images de 2 Hz ou 30 Hz que non seulement un neurone, mais plusieurs neurones peuvent être stimulés holographiquement simultanément (Figure 3E).
5. Effectuez l’acquisition d’images avec le protocole suivant : imagez simultanément la réponse Ca²⁺ à 920 nm avec 10 stimuli holographiques à 1 040 nm avec des intervalles de 8 s (0,125 Hz) pendant une durée de 50 ms après une période de référence de 10 s.

Figure 1 : Schéma de la procédure expérimentale. (A) Fixation de la plaque de tête au crâne. (B) Injection stéréotaxique d’AAV dans la zone de la patte arrière du cortex somatosensoriel primaire (S1HL). (C) Implantation de la fenêtre crânienne. Pour évaluer et manipuler l’activité neuronale, l’imagerie in vivo Ca2+ est réalisée chez des souris éveillées (D) avec stimulation holographique (E). Les marques de flash indiquent une stimulation holographique ou un éclairage.

Figure 2 : Organigramme de la façon de calibrer le système de stimulation holographique ou d’éclairage. Cet organigramme décrit les étapes d’étalonnage d’un système de stimulation holographique ou d’éclairage en fonction de l’espace d’échantillonnage et du système d’imagerie. Veuillez consulter l’étape 3, préparation du système de stimulation holographique ou d’éclairage, pour des instructions détaillées et télécharger un exemple de programme.

Figure 3 : Résultats représentatifs de l’imagerie et de la connectivité fonctionnelle à l’aide d’un microscope holographique. (A) Pour éclairer des neurones spécifiques exprimant jGCaMP8f ou GCaMP6m-P2A-ChRmine, l’image des neurones est capturée, puis une tache est formée sur le neurone à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. (B) Le réglage du capteur d’image (temps d’exposition, zone d’imagerie et binning). (C) Image représentative et traces de neurones exprimant jGCaMP8f en imagerie 100 Hz avec éclairage holographique et capteur d’image. (D) Ce graphique montre la réponse neuronale à la stimulation holographique (1 040 nm) à chaque puissance laser (données de GCaMP6m-P2A-ChRmine exprimant des neurones à une fréquence d’images de 2 Hz [n = 16]). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne. (E) Traces représentatives Ca2+ pendant la stimulation holographique (lignes verticales bleues) de 10 neurones différents à des fréquences d’images d’imagerie de 2 Hz (à gauche) et 30 Hz (à droite). Dans les traces de 2 Hz et 30 Hz Ca2+, la même couleur indique le même neurone. (F) Schéma de principe évaluant les connexions fonctionnelles entre les neurones. Lorsque le neurone orange est stimulé, les neurones rouges répondent en même temps, indiquant qu’il existe une connectivité fonctionnelle entre ces neurones. (G) Une image typique de neurones S1HL exprimant GCaMP6m en type sauvage (WT). Barre d’échelle = 10 μm. (H) Traces typiques de Ca2+ lors de la stimulation holographique (lignes verticales bleues) à des fréquences d’images d’imagerie de 2 Hz (supérieur) et 30 Hz (inférieur). Le neurone stimulé est entouré en orange, les neurones répondeurs sont entourés de rouge et les neurones non répondeurs sont entourés de gris. La réactivité neuronale à la stimulation holographique peut être détectée à des vitesses d’imagerie de 2 Hz et de 30 Hz.

Figure 4 : Système utilisé pour le microscope holographique. (A) Images des trajets lumineux de stimulation holographique et d’éclairage (à gauche) près du microscope (au milieu) avec un capteur d’image (à droite). (B) Il s’agit d’images agrandies de trajets lumineux de stimulation holographique et d’éclairage autour des SLM respectifs (gauche et droite) et d’un trajet lumineux ponctuel autour d’une tête de balayage (au milieu et à droite). (C) Un schéma des chemins optiques de stimulation et d’imagerie. Les SLM à phase seule sont utilisés pour afficher des hologrammes numériques, et un extenseur de faisceau (une combinaison de L1 et L2) et un système de relais 4f (une combinaison de L3 et L4 pour la stimulation holographique et de L4 et L5 pour l’éclairage holographique) sont placés avant et après les SLM respectifs pour s’assurer que chaque hologramme numérique est imagé à la pupille de sortie d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau. avec une taille d’image légèrement sous-remplie. Pour supprimer les composants résiduels d’ordre zéro, un bloc de poutre est placé sur le plan intermédiaire.