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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Configuration du microscope pour l’imagerie en accéléré
1. Détermination des paramètres laser
1. Détermination de la longueur d’onde laser à utiliser. Utilisez une longueur d’onde qui est le double de la longueur d’onde d’excitation du fluorophore d’intérêt (par exemple, une longueur d’onde comprise entre 880 et 940 nm pour la protéine fluorescente verte (GFP).
REMARQUE : Dans la présente étude, le réglage de la longueur d’onde pour la GFP était compris entre 880 et 940 nm. Plus la longueur d’onde est élevée, plus la puissance de sortie du laser est faible.
2. Déterminez la transmission laser. Un pourcentage élevé de transmission laser tuera l’embryon, utilisez le niveau de transmission le plus bas (recommandé). Pour les études en accéléré de 24 à 48 heures, telles que présentées ici, maintenez la transmission en dessous de 5 %.
3. Déterminez les systèmes de détection du microscope et assurez-vous que les filtres appropriés pour le fluorophore sont en place.
REMARQUE : Pour les microscopes multiphotons, il existe plusieurs systèmes de détection avec différentes sensibilités pour la fluorescence émise. En général, un système de détection interne est moins sensible qu’un système de détection externe. Pour les lignées transgéniques avec des niveaux élevés d’expression de GFP, le système de détection interne est adéquat. Pour les lignées transgéniques avec de faibles niveaux d’expression de la GFP ou avec d’autres fluorophores (par exemple, la protéine fluorescente rouge), un système de détection externe peut être nécessaire pour maintenir le pourcentage de transmission laser à un niveau raisonnable. Quel que soit le système de détection utilisé, les filtres appropriés pour le fluorophore doivent être en place.
2. Réglage des paramètres du logiciel sur le microscope multiphoton
1. À l’aide de l’objectif 5X, localisez l’embryon. Soulevez manuellement la platine à la position la plus haute et utilisez la mise au point fine pour positionner l’embryon au milieu de la portée du microscope.
2. Abaissez manuellement la platine et changez l’objectif 5X en objectif à immersion dans l’eau 25X (ouverture numérique NA, 0.95). Soulevez soigneusement la scène pour ramener l’embryon au point.
3. Dans le logiciel, cliquez sur le mode « xyzt » pour obtenir plusieurs images à intervalles de temps (t) dans le plan x-y sur une profondeur de « z ». Utilisez la vue épifluorescence ou en fond clair pour trouver la profondeur de champ dans la zone d’intérêt, ce qui délimitera la pile Z.
1. Dans le logiciel, cliquez sur le bouton « commencer » ; pour ces expériences, le bord latéral de l’œil était le début de la pile Z. Cliquez sur le bouton « Fins » ; la ligne médiane de l’embryon était l’extrémité de la pile Z.
REMARQUE : La taille du pas était de 0,3 à 0,6 μm et il y avait un total de ~200 pas pour une taille de pile z de 60 à 120 μm).
4. Cliquez sur le menu pour ajuster le temps d’acquisition et la fréquence d’imagerie.
Pour le système actuel, ~200 étapes nécessitent environ 5 min pour chaque acquisition de z-stack. Pour une récupération adéquate du fluorophore et la survie de l’embryon, prévoyez un rapport d’au moins 1:3 entre l’acquisition de la pile z (mise sous tension du laser) et le temps de récupération (mise sous tension du laser).
REMARQUE : Par exemple, les piles z sont acquises toutes les 20 minutes avec 5 minutes d’acquisition de la pile Z et 15 minutes de récupération. Pour ce protocole, des piles z plus grandes peuvent être obtenues, mais augmenteraient de manière appropriée le temps entre les acquisitions de piles z, ce qui entraînerait moins d’images au cours du laps de temps.
1. Avec un temps approprié pour la récupération de l’embryon, réglez le temps entre les piles z dans la fenêtre désignée. Définissez la durée totale de l’expérience dans la fenêtre appropriée.
5. Derniers ajustements du logiciel, du laser et de l’embryon.
1. Activez le réglage de l’image en direct pour effectuer les derniers ajustements des paramètres laser. Ajustez la transmission laser, le gain et le décalage des curseurs dans le logiciel pour optimiser l’image fluorescente. Ajustez également l’orientation de l’embryon, au besoin, en fonction de la durée de l’expérience, de la croissance prévue de l’embryon, etc. Assurez-vous que la zone d’intérêt reste dans le cadre pendant toute la durée de l’expérience.
2. Éteignez la source de lumière épifluorescente car elle n’est plus nécessaire lors de l’acquisition en accéléré. Couvrez la platine à l’aide du boîtier de sécurité laser (Figure 1I). Lors de l’utilisation du système de détection interne, le boîtier de sécurité laser est adéquat pour la protection contre la lumière de fond. Appuyez sur « start ».
REMARQUE : Cependant, avec des systèmes de détection externes plus sensibles, le boîtier de sécurité laser ne bloque pas suffisamment la lumière de fond et des couvercles supplémentaires sont nécessaires pour éviter de perturber l’acquisition d’images.
2. Pendant l’acquisition en accéléré
1. Remplissez la chambre de bain ouverte avec du milieu embryonnaire time-lapse toutes les 8 à 12 h (au moins 2 fois par jour) pendant l’acquisition time-lapse à travers les portes coulissantes du boîtier de sécurité laser (Figure 1I).
2. Avant d’ouvrir les portes du boîtier de sécurité laser, assurez-vous que le microscope n’est pas en train d’acquérir activement une image.
REMARQUE : L’utilisation de réchauffeurs et de systèmes de fluides circulants n’est pas nécessaire pour les expériences d’imagerie en accéléré d’une durée de 24 à 48 h. En effet, les températures des réchauffeurs de scène et en ligne sont difficiles à contrôler, et lors de l’acquisition de l’image, l’embryon présente un taux de développement adéquat à une plage de température de 25 à 28 °C. De plus, les systèmes de fluides circulants ont tendance à déborder et à endommager potentiellement l’équipement. Ainsi, tous les embryons sont systématiquement stadés après l’acquisition.
3. Traitement post-acquisition
1. Dans le logiciel, cliquez sur le menu « fichier » et choisissez « enregistrer ».
2. Ouvrez le fichier dans un logiciel de traitement d’images (voir la Table des matériaux). Mettez en surbrillance la série d’images correcte. Dans le logiciel, choisissez le menu « Process ». Cliquez sur Déconvolution 3D et « Appliquer » pour déconvolution chaque z-stack.
REMARQUE : Le fichier est volumineux ; Par conséquent, cette étape peut prendre plusieurs heures.
3. Dans le logiciel, sous le menu « Process », cliquez sur « projection maximale ». Cliquez sur « Appliquer » pour lancer la projection maximale afin de générer 1 image par z-stack. Exportez chaque fichier projeté maximum (1 image par z-stack) sous forme de tiff.
4. Importez des fichiers tiff individuels dans un logiciel de traitement vidéo. Sélectionnez tous les fichiers tiff et faites-les glisser dans l’éditeur vidéo. Ajustez la longueur de chaque image de la vidéo à 0,1 s. Exportez la vidéo sous forme de fichier mov ou mp4.
