Visualisation des modèles de projection axonale des motoneurones embryonnaires chez la drosophile

1. Préparation

1. Préparez 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une solution de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (PBT) en ajoutant 0,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) et 0,5 mL de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (voir le tableau des matières) à 500 mL de 1X PBS et en agitant pendant au moins 30 min. Conserver à 4 °C. Utiliser lorsqu’il est relativement frais et conserver la solution dans une bouteille propre.
2. Préparez 10 ml de paraformaldéhyde à 4 % en ajoutant 2,5 ml de solution mère de paraformaldéhyde à 16 % et 1 ml de 10x PBS à 6,5 ml d’eau désionisée. Conserver à 4 °C et utiliser dans un délai d’une semaine.
   ATTENTION : Éviter tout contact cutané avec une solution de paraformaldéhyde car elle est hautement toxique.
3. Fabriquer un substrat de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) (10 % p/v de X-Gal dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)) en dissolvant 0,1 g de substrat X-Gal pour 1 mL de DMSO. Conserver à -20 °C dans des aliquotes de 100 μL.
4. Préparez la solution de coloration X-Gal à l’aide d’un tampon phosphate de 10 mM (pH 7,2), de chlorure de sodium de 150 mM, de NaCl, de chlorure de magnésium de 1 mM, de MgCl₂, de ferrocyanure de potassium de 3 mM, de K₄[FeII(CN)₆], de ferricyanure de potassium de 3 mM, de K₃[FeIII(CN)₆] et de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol à 0,3 %. Conserver à 4 °C dans l’obscurité.
5. Préparez une solution de peroxyde d’hydrogène à 3 % en diluant 30 % de peroxyde d’hydrogène 1:10 avec de l’eau désionisée.
6. Préparez une solution de 3,3′-diaminobenzidine (DAB) en dissolvant complètement 1 comprimé (10 mg) de DAB dans 35 mL de solution PBT fraîche. Filtrer à travers un filtre à seringue de 0,2 μm et stocker à -20 °C dans des aliquotes de 910 μL.
   ATTENTION : Jetez tous les déchets DAB dans de l’eau de Javel pour détruire le DAB.
7. Préparez des assiettes d’œufs avec du jus de pomme. Ajouter 35 g de gélose et 1 L d’eau déminéralisée dans une fiole de 2 L. Ajouter 33 g de saccharose, 2 g de tegosept et 375 ml de jus de pomme dans une fiole de 1 L. Faites-les fondre à l’autoclave pendant 30 min. Laissez refroidir les deux solutions à environ 60 °C. Combinez et mélangez bien ces solutions en remuant. Verser ~11 mL de la solution combinée par boîte de culture de 60 mm.
8. Préparez la pâte de levure en mélangeant la levure de boulanger dans de l’eau désionisée (rapport 1:0,8) et conservez-la à 4 °C.

2. Collecte d’embryons (jour 1)

1. Collectez les jeunes mouches femelles et mâles (moins de 5 jours) et, pendant 1 à 2 jours, conservez-les dans une cage en plastique avec une plaque d’œuf (60 mm x 15 mm) qui contient une petite quantité de pâte de levure au centre.
2. Pour une collecte optimale d’embryons à un stade avancé de 16 ans, installez un porte-bidon avec des mouches (> 50) vers 17 heures et laissez-les pondre des œufs à 25 °C pendant 3 h.
3. Transférez les mouches dans une bouteille de nourriture fraîche.
4. Fermez la plaque d’œufs avec le couvercle et incubez-la à l’envers à 25 °C dans un incubateur humidifié (~70 % d’humidité) pendant la nuit.

3. Préparation des embryons pour l’immunomarquage (jour 2)

1. Ajoutez 1,8 ml de solution PBT dans la plaque d’œuf vers 10h20 et utilisez un coton-tige pour détacher les embryons de la plaque tout en l’inclinant.
   REMARQUE : En écrasant doucement la pâte de levure à l’aide d’un coton-tige, dissolvez-la au cas où un grand nombre d’embryons s’y trouverait. Commencez à collecter les embryons ~40 min avant la fixation (vers 11h00).
2. Transférez les embryons de la plaque d’œuf dans un microtube de 1,5 ml à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml.
3. Laissez les embryons se stabiliser et aspirez la solution PBT autant que possible. Rincez les embryons deux fois avec 1 ml de solution PBT. Aspirez la solution PBT autant que possible.
4. Remplissez le tube avec 1 mL d’eau de Javel à 50 % (c.-à-d. dilué dans de l’eau déminéralisée) et déchorionnez les embryons en les incubant sur un nutator pendant 3 minutes à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Cette étape ne tue pas les embryons déchorionnés.
5. Laissez les embryons déchoionnés se déposer, aspirez l’eau de Javel à 50 % autant que possible et rincez les embryons 3 fois avec 1 ml de solution PBT.
6. Ajouter 0,5 mL d’heptane et ensuite ajouter 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde à 4 % dans le tube à RT vers 11h00.
7. Incuber les embryons sur un nutator pendant 15 min à RT.
8. Retirer la solution de paraformaldéhyde à 4 % (la couche inférieure).
9. Ajouter 0,5 mL de méthanol à 100 % et dévitelliniser les embryons en secouant vigoureusement le tube pendant 30 s.
10. Retirez l’heptane (c’est-à-dire la couche supérieure).
11. Ajouter 0,5 mL de méthanol à 100 % et agiter vigoureusement le tube pendant 10 s.
12. Laissez les embryons se déposer en tapotant le tube et aspirez le méthanol autant que possible. Rincer les embryons avec 1 mL de méthanol à 100 %, en les secouant pendant moins de 10 s.
    REMARQUE : Une exposition prolongée au méthanol détruit l’activité du β-Gal.
13. Retirez le méthanol et rincez les embryons dévitellinisés 3 fois avec 1 mL de solution PBT.

4. Génotypage des embryons à l’aide de la coloration LacZ (jour 2)

1. Ajoutez 1 ml de solution PBT dans le tube et incubez le tube dans un bloc de chaleur à 37 °C ou un bain-marie pendant 15 min.
2. Pendant l’incubation, placer la solution de coloration X-Gal (1 mL par tube) à 65 °C dans un bain-marie jusqu’à ce qu’elle devienne trouble. Incuber au bain-marie à 37 °C.
3. Aspirez la solution PBT et ajoutez 1 mL de solution de coloration X-Gal et 20 μL de substrat X-Gal dans le tube.
4. Incuber le tube à 37 °C avec nutation jusqu’à ce qu’un précipité bleu apparaisse.
   REMARQUE : Le temps d’incubation des 2ème et 3ème équilibreurs bleus varie généralement de 2 à 4 h.
5. Retirez la solution de coloration X-Gal et rincez les embryons 3 fois avec 1 ml de solution RT PBT.
6. À l’aide d’une sonde à aiguille ou d’une pince, triez à la main les embryons du génotype souhaité (c’est-à-dire des embryons blancs non colorés) à l’aide d’un microscope à dissection de la lumière (objectifs 1,6X-2,5X).
   REMARQUE : Étant donné que certains équilibreurs bleus, tels que CyO, actin-LacZ et TM3, actin-LacZ, portent une construction transgénique exprimant la β-Gal bactérienne (LacZ) sous le contrôle de l’actine Promoteur, les embryons colorés en bleu de manière omniprésente contiennent une ou deux copies de chromosomes équilibreurs bleus. Par conséquent, les embryons blancs non colorés sont homozygotes pour l’allèle létal souhaité.

5. Immunomarquage d’embryons avec des anticorps antifasciclins II (jours 2-3)

1. Prélevez et transférez les embryons du génotype souhaité (c’est-à-dire des embryons blancs non colorés) dans un microtube de 0,5 ml à l’aide d’une pointe de pipette de 1 ml.
   REMARQUE : Dans cette étape, les embryons peuvent être grossièrement stadifiés selon des critères morphologiques, y compris les modèles de segmentation de la cuticule et les structures de la tête et de la queue. Lors de l’involution de la tête, entre 10 et 16 heures après la ponte des œufs, l’embryon subit une réduction prononcée du segment antérieur.
2. Lavez les embryons une fois avec 0,4 ml de solution PBT et ajoutez 0,3 ml de solution bloquante (5 % de sérum de chèvre normal et 5 % de DMSO dans une solution de PBT).
3. Bloquer les embryons avec nutation à RT pendant 15 min.
4. Ajouter 75 μL d’anticorps anti-fasciclin II et incuber le tube avec nutation à RT pendant la nuit.
5. Lavez les embryons 4 fois avec 0,4 ml de solution PBT pendant au moins 20 minutes par lavage.
6. Ajouter 0,3 mL de solution bloquante (5 % de sérum de chèvre normal dans une solution PBT) contenant un anticorps anti-souris-raifort peroxydase (anti-souris-HRP) de chèvre (2 μg/mL) et incuber le tube avec nutation à RT pendant la nuit.
7. Lavez les embryons 6 fois avec 0,4 mL de solution PBT pendant au moins 20 minutes par lavage.
8. Ajoutez 0,3 ml de solution DAB dans le tube.
   ATTENTION : Portez des gants et placez tous les déchets/tubes/pointes DAB dans de l’eau de Javel.
9. Ajouter 2 μL de peroxyde d’hydrogène à 3 % et incuber le tube dans l’obscurité avec nutation à RT jusqu’à ce que la quantité désirée de précipité soit produite.
   REMARQUE : Le temps d’incubation pour l’immunohistochimie 1D4 varie généralement de 0,5 à 1 h.
10. Lavez les embryons 4 fois avec 0,4 mL de solution PBT.
    ATTENTION : Retirez la solution DAB et les deux premiers lavages à l’aide d’une pipette et jetez-les dans de l’eau de Javel.
11. Ajouter 0,2 ml de solution de montage de glycérol/PBS à 70 % dans le tube et stocker à RT ou 4 °C.
    REMARQUE : Garder le tube à l’abri de la lumière. Des préparations plus claires peuvent être obtenues en plaçant les embryons dans une solution de glycérol/PBS à 90 %. Cependant, il est plus difficile de disséquer les embryons éliminés dans une solution de glycérol/PBS à 90 % que ceux éliminés dans une solution de glycérol/PBS à 70 %.

6. Stadification, dissection, montage et imagerie des embryons (jour 4)

1. Pour la stadification, transférez les embryons équilibrés avec 70 % de glycérol/PBS sur une lame de verre.
2. Prélever des embryons de stade avancé de 16 qui ont des nerfs du nerf intersegmentaire (ISN) des segments abdominaux 7 (A7), A8 et A9 qui convergent pour se toucher ou/et dont l’intestin moyen est subdivisé en trois bandes.
   REMARQUE : Les embryons colorés avec l’anticorps 1D4 peuvent être stadifiés en fonction des modèles de projection des axones moteurs ISN et ISNb. Après avoir quitté le système nerveux central (SNC), les nerfs ISN A7, A8 et A9 des embryons de stade 16 avancé convergent pour se toucher et divergent ensuite pour s’étendre loin vers les muscles dorsaux (pointe de flèche dans la figure 1A). Chez les embryons de stade intermédiaire 16, cependant, les nerfs A7 ISN s’étendent parallèlement aux nerfs A8/A9 (crochet sur la figure 1B). De plus, les axes de projection des nerfs A6 ISNb (perpendiculaires aux muscles ventrolatéraux) dans les deux hémisegments sont grossièrement alignés avec l’extrémité postérieure des faisceaux axonaux longitudinaux du SNC (flèches et ligne sur la figure 1C). Ces critères morphologiques varient entre les différents génotypes. Alternativement, les embryons peuvent être stadifiés en fonction de la morphologie intestinale. Avant le stade 17, l’intestin moyen a une forme en forme de cœur, tandis que l’intestin moyen est subdivisé en trois bandes au stade 17.
3. Disséquez les embryons.
   1. À l’aide d’une seringue de 1 ml, retirez chaque embryon de la goutte de glycérol et placez l’embryon face ventrale vers le haut. Coupez la partie antérieure à 1/4 de la longueur du corps et la région la plus postérieure qui est libre d’axones moteurs.
   2. À l’aide d’une sonde à aiguille, sortez l’embryon coupé en bout de la goutte de glycérol, roulez-le pour l’orienter du côté dorsal vers le haut et placez-le horizontalement dans le champ.
      REMARQUE : Lorsque l’embryon est retiré de la goutte de glycérol, un peu de glycérol associé à l’embryon le rend collant.
   3. Coupez l’embryon le long de la ligne médiane dorsale à l’aide d’une seule aiguille de tungstène très fine. Faites une petite incision à l’extrémité postérieure de l’embryon, puis continuez à couper la ligne médiane dorsale vers l’antérieur ; Couper dans la direction opposée est également acceptable.
   4. À l’aide d’une sonde à aiguille, déplacez l’embryon coupé à mi-chemin dans la goutte de glycérol, placez-le côté dorsal vers le haut et détachez l’intestin de la paroi du corps en dépliant chaque paroi corporelle dans une direction ventrolatérale (diagonale) (objectif 2,5X).
      REMARQUE : Assurez-vous que la ligne médiane dorsale est complètement coupée, ce qui entraîne une séparation complète entre les parois gauche et droite du corps.
   5. Déplacez avec précaution l’embryon coupé à mi-chemin de la goutte de glycérol, puis posez deux rabats de la paroi corporelle sur la lame de verre à l’aide d’une sonde à aiguille fine (objectif 2,5X).
   6. À l’aide d’une aiguille en tungstène très fine, prélevez les organes internes de l’embryon disséqué en les poussant latéralement (objectif 5X).
      REMARQUE : Une description plus détaillée d’une autre procédure de dissection similaire peut être trouvée sur le site Web.
4. Pour le montage, ajoutez 2 à 3 μL de solution de glycérol/PBS à 70 % sur des embryons propres et disséqués et, à l’aide d’une sonde à aiguille fine, transférez-les sur une nouvelle lame de verre sur laquelle 8 μL de solution de glycérol/PBS à 70 % ont été étalés au centre (objectif 2,5X).
5. Mettez une lamelle (18 mm x 18 mm). Scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles ordinaire (transparent ou coloré, c’est bien).
6. Capturez des images à haute résolution (objectifs à immersion dans l’huile 20X, 40X et 63X) à l’aide d’un microscope optique à contraste interférentiel différentiel (CID), conformément aux instructions du fabricant.
   REMARQUE : L’utilisation d’un objectif à immersion dans l’huile 63X permet d’améliorer la visualisation et la caractérisation phénotypique, en particulier pour les axones moteurs ISNb.

Figure 1 : Stadification des embryons basée sur les modèles de projection des axones moteurs ISN et ISNb. (A) Chez les embryons de type sauvage de stade avancé 16, les nerfs ISN A7, A8 et A9 (flèches) convergent pour se toucher (pointe de flèche). L’antérieur est gauche et le ventral est vers le bas. La barre d’échelle = 15 μm. (B) Chez les embryons de type sauvage de stade intermédiaire 16, le nerf A7 ISN s’étend parallèlement aux nerfs A8/A9 (crochet). Les flèches indiquent les nerfs ISN A7, A8 et A9. L’antérieur est gauche et le ventral est vers le bas. La barre d’échelle = 15 μm. (C) Préparation en filets d’embryons de type sauvage de stade 16 tardif colorés avec l’anticorps FasII. Les axes de projection (flèches) des nerfs A6 ISNb gauche et droit sont grossièrement alignés avec l’extrémité postérieure des faisceaux axonaux longitudinaux du SNC (ligne noire). Les segments abdominaux A1-A7 sont étiquetés en haut. L’antérieur est gauche. La barre d’échelle = 15 μm.