Imagerie in vivo du cerveau d’une larve de poisson-zèbre pour visualiser les neurones cérébelleux

Résumé

Source : Schramm, P. et al. Imagerie in vivo du tissu cérébral entièrement actif chez les larves et les juvéniles de poisson-zèbre éveillés par ablation du crâne et de la peau. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’imagerie in vivo des neurones cérébelleux chez les larves de poisson-zèbre transgénique, qui expriment des protéines fluorescentes dans les neurones de Purkinje. Le processus consiste à anesthésier les larves, à les immobiliser dans de l’agarose et à retirer soigneusement la peau pigmentée pour améliorer la pénétration de la lumière et l’intensité de la fluorescence. Enfin, les échantillons préparés sont imagés au microscope confocal pour visualiser clairement les neurones marqués.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Anesthésie des larves et préparations pour l’enrobage
   1. Lorsque vous commencez l’expérience pour la journée, transférez les animaux nécessaires avec une pipette Pasteur en plastique dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre, qui est remplie soit de Danieau (pour les larves qui sont encore conservées dans une boîte de Pétri avec Danieau), soit d’eau de la pisciculture (pour les larves qui ont plus de 7 jours après la fécondation [dpf] et qui sont conservées dans l’installation de poisson).
      1. Lorsque vous pipetez des poissons de plus de 2 semaines, assurez-vous que l’ouverture de la pipette est suffisamment grande pour éviter de blesser les poissons lors de leur transfert. N’utilisez pas de filet car cela endommagerait physiquement les poissons, en particulier les jeunes larves.
   2. Ajoutez des nauplius de rotifera ou d’artémia adaptés à la taille des larves conservées dans la boîte de Pétri pour assurer le libre accès à la nourriture et l’état de santé maximal des larves et réduire le stress.
   3. Pour l’enrobage, transférez les larves sélectionnées dans une boîte de Pétri de 35 mm de diamètre remplie de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF). Ajouter le volume nécessaire de d-Tubocurarine pour atteindre une concentration de travail/dose efficace de 10 μM et attendre quelques minutes jusqu’à ce que les larves soient complètement immobilisées.
      REMARQUE : Lorsque les poissons vieillissent ou si une anesthésie complète plus rapide est nécessaire (moins de 5 min), il est possible d’augmenter la concentration de d-Tubocurarine (DL50 pour les souris est de 0,13 mg/kg par voie intraveineuse). Il est également possible d’utiliser un anesthésique différent, tel que la α-bungarotoxine (concentration de travail : 1 mg/mL), qui a le même effet que le curare et maintient également le cerveau pleinement actif. Si un cerveau entièrement actif n’est pas nécessaire pour le sujet d’intérêt, la tricaïne à une dose non létale (0,02 %) est également une option pour anesthésier complètement les larves. Cependant, la tricaïne bloque les canaux sodiques, altérant ainsi l’activité cérébrale.
   4. Préparez la chambre de montage en prenant le couvercle de la boîte de Pétri de 35 mm de diamètre, en retournant le couvercle et en plaçant une lamelle carrée en verre (24 x 24 mm) au bas du couvercle. Voir la figure 1 (partie supérieure) pour une description schématique de ces étapes. La surface plus lisse du verre empêche le glissement du bloc d’agarose, qui contient les larves pendant la procédure d’ouverture du crâne.
   5. Aliquote la quantité d’ACSF nécessaire pour la journée dans un flacon approprié (p. ex., tube de 50 ml, bécher, bouteille Schott, etc.) et oxygénée-la avec du carbogène (5 % CO₂, 95 % O₂). Si l’imagerie uniquement de la morphologie (par exemple, les motifs de fluorescence) ACSF est toujours nécessaire pour assurer l’intégrité du cerveau et que les cellules ne sont pas influencées négativement par les effets d’osmolarité, mais l’oxygénation de l’ACSF n’est pas nécessaire. Cette étape ne doit être effectuée que lorsque l’activité cérébrale complète est nécessaire pour l’imagerie.
      REMARQUE : Pour une saturation optimale en oxygène du milieu, ajoutez une pierre à air à l’extrémité du tube de carbogène. Pour garantir un niveau d’oxygène suffisamment élevé, il est nécessaire de remplacer l’ACSF dans les chambres d’imagerie par de l’ACSF fraîchement oxygéné toutes les 20 à 60 minutes, en fonction du nombre et de l’âge des larves incrustées dans la même chambre d’imagerie (par exemple, pour une seule larve encastrée, un échange d’ACSF toutes les heures est suffisant. Pour six larves de plus de 14 dpf intégrées en parallèle, il est nécessaire de changer d’ACSF toutes les 20 minutes, alors prévoyez la quantité nécessaire d’ACSF saturé en oxygène selon l’expérience prévue.
2. Intégration des larves
   1. Transférez les larves entièrement anesthésiées avec une pipette Pasteur en plastique dans la chambre de montage préparée (à l’étape 1.4). Ensuite, retirez soigneusement l’excès de milieu pour éviter la dilution de l’agarose à bas point de fusion (LM). Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées sous un stéréomicroscope avec un grossissement suffisant.
      REMARQUE : L’inclinaison de la chambre de montage peut aider à retirer complètement le fluide.
   2. Passez immédiatement à l’étape suivante, en ajoutant une goutte d’agarose LM suffisamment grosse sur les larves (environ 1 ml, selon la taille des larves) pour protéger les animaux du dessèchement et pour réduire le stress inutile.
   3. Orientez les larves en position avant que l’agarose ne se solidifie. Assurez-vous que la partie dorsale des larves est dirigée vers le haut. Assurez-vous également d’enfoncer les larves aussi près que possible de la surface de l’agarose.
      REMARQUE : Selon la taille et le nombre de larves prévues pour s’incruster en même temps, il est possible d’ajuster la concentration d’agarose. Par exemple, pour 1 à 3 larves âgées de 30 dpf, une concentration de 1,8 % à 2 % d’agarose LM est recommandée. Pour 1 à 4 larves âgées de 7 dpf, il est plus pratique d’utiliser 2,5 % d’agarose LM, tandis que pour 5 à 8 larves, 2 % est plus approprié. Si un cerveau pleinement actif est nécessaire, il est recommandé d’intégrer seulement trois poissons en même temps pour réduire le temps nécessaire au fonctionnement des larves. En général, il est recommandé d’utiliser des concentrations plus faibles (1,8 % à 2 %) au fur et à mesure que les larves vieillissent ou qu’il est prévu d’incruster davantage de larves en même temps.
   4. Si les images sont enregistrées à l’aide d’un microscope inversé, coupez le bloc d’agarose contenant les larves en une forme de petit cuboïde. Ceci est important pour transférer les larves dans la chambre d’imagerie plus tard. Si vous utilisez un microscope droit, un tel rognage n’est pas nécessaire, car la chambre de montage peut également être utilisée comme chambre d’imagerie. La figure 1 (partie supérieure) présente une description schématique de ces étapes.
3. Exposition du cerveau
   REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec le plus grand soin pour ne pas blesser inutilement les larves. Si un cerveau entièrement actif est nécessaire pour l’expérience, gardez à l’esprit qu’à chaque seconde qui passe, alors que le poisson est encore entièrement monté dans l’agarose et a le crâne ouvert sans ACSF oxygéné, le cerveau souffrira d’un manque d’oxygène et se dessèchera. Les effets du manque d’oxygène deviendront encore plus dramatiques à mesure que les larves incrustées seront âgées. Par conséquent, il est important d’effectuer la chirurgie non seulement dans les plus brefs délais, mais aussi avec une précision maximale pour éviter les lésions cérébrales mécaniques avec l’aiguille. Les étapes 3.2 à 3.4 ne devraient pas prendre plus de 30 s par poisson lorsqu’il est formé.
4. Commencez la chirurgie dès que l’agarose s’est solidifiée. Tout d’abord, coupez tout l’excès d’agarose au-dessus de la région cérébrale d’intérêt pour obtenir un accès libre à la tête et un espace de travail dégagé. Si la partie dorsale de la tête dépasse déjà de l’agarose, sautez cette étape.
5. Selon la région d’intérêt, choisissez un endroit pour commencer la chirurgie. Prenez l’aiguille de verre et faites une petite incision à travers la peau sans pénétrer trop profondément dans les tissus. Ce sera le point de départ pour décoller la peau de recouvrement.
   REMARQUE : Pour des résultats optimaux, ne commencez jamais directement au-dessus de la région d’intérêt afin de réduire le risque d’endommager les structures importantes. Si nécessaire, il est possible de commencer par l’arrière du cerveau postérieur et de travailler vers l’avant jusqu’à ce que la zone indésirable de la peau soit décollée.
6. Continuez avec de très petites coupures le long de la partie de la peau, en visant à enlever en déplaçant à peine l’aiguille juste sous la surface. La plupart du temps, il n’est pas nécessaire de se déplacer complètement autour du cerveau et de découper un morceau de peau et de crâne en forme de cercle, mais plutôt de faire deux incisions le long de la tête, puis de repousser la peau d’un côté ou de l’autre. La figure 2 montre une représentation schématique de la stratégie de coupe optimale pour obtenir un accès libre au cervelet.
   REMARQUE : Cette microchirurgie est une procédure délicate, et elle nécessitera très probablement un peu d’entraînement pour enlever parfaitement la peau sans endommager le cerveau sous-jacent. Il est également recommandé de trouver la stratégie de coupe optimale pour la région cérébrale d’intérêt et de s’y tenir pendant toute la durée de l’expérience.
7. Immédiatement après avoir retiré la peau de toutes les larves incrustées, versez de l’ACSF (oxygéné) sur l’agarose pour inonder les particules de peau et le sang indésirables, garder le cerveau pleinement actif et le protéger du dessèchement.
   REMARQUE : Si un cerveau sain est nécessaire pour l’expérience, il est recommandé d’opter pour un maximum de trois poissons à la fois.
8. Si vous utilisez un microscope droit, commencez directement par l’imagerie.
   1. Lorsque vous utilisez un microscope inversé, glissez une petite spatule sous le bloc d’agarose cuboïde (étape 2.4).
   2. Ajoutez une petite goutte d’agarose LM au fond de la chambre d’imagerie (par exemple, une parabole à fond de verre) et retournez immédiatement le bloc d’agarose contenant les larves avec la spatule à 180° et poussez-le doucement vers le fond de la chambre d’imagerie, tandis que la goutte d’agarose liquide agit comme de la colle.
   3. Lorsque l’agarose s’est solidifiée, remplissez la chambre d’imagerie avec de l’ACSF (oxygéné), puis commencez l’imagerie. Voir la figure 1 (partie inférieure) pour une description schématique.
9. Lorsque l’activité cérébrale est nécessaire pour l’expérience, assurez-vous toujours que l’ACSF dans la chambre d’imagerie a un niveau d’oxygène suffisamment élevé. Pour ce faire, le milieu doit être remplacé avec précaution par de l’ACSF fraîchement oxygéné toutes les 20 à 60 minutes (en fonction du nombre et de la taille des poissons, de la taille et de la surface de la chambre d’imagerie et de la durée de l’imagerie).

Résultats

Figure 1 : Procédure schématique pour la préparation de l’imagerie par étapes de in vivo}. Les instructions de travail pour les différentes étapes se trouvent dans le graphique lui-même. Graphisme co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope confocal à balayage laser	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Verre capillaire type 1	WPI	1B150F-4
Verre Capillaire type 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Plaque en verre	deltalab	D102424
Chambre d’imagerie	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Caméra microscope	Leica	DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1	NARISHIGE	Modèle PC-10
Extracteur d’aiguille type 2	Sutter Instruments	Modèle P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Boîte de Pétri 35 mm	Sarstedt	833900
Boîte de Pétri 90 mm	Sarstedt	821473001