Caractérisation des propriétés mécaniques du tissu cérébral de souris à l’aide de la microscopie à force atomique

Abstract

Source : Canovic, E. P., et al. Caractérisation des propriétés mécaniques multi-échelles du tissu cérébral à l’aide de la microscopie à force atomique, de l’indentation par impact et de la rhéométrie. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie à force atomique (AFM) pour mesurer les propriétés viscoélastiques du tissu cérébral, où un porte-à-faux avec une sonde sphérique interagit avec le tissu et se plie sous les forces appliquées. Un faisceau laser dévié sur un détecteur suit le porte-à-faux pour mesurer la profondeur d’indentation et la relaxation de la force, ce qui permet de caractériser les propriétés mécaniques des tissus.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Indentation à l’aide d’un microscope à force atomique (AFM)

1. Préparez des boîtes de Pétri (P60) de 60 mm de diamètre avec un bioadhésif dérivé des moules selon les instructions du fabricant.
   1. Préparez une solution mère de solution tampon neutre composée de bicarbonate de sodium 0,1 M dans de l’eau stérile avec un pH optimal de 8,0. Stérilisez à filtre (0,2 micron) le tampon de bicarbonate de sodium et stockez-le à 4 °C.
   2. Dans une hotte à flux laminaire, mélangez une solution de bio-adhésif dérivé de moules à 6,25 % et d’hydroxyde de sodium (NaOH) à 3,125 % dans le tampon de bicarbonate de sodium.
   3. Pipetez 100 μl de la solution bio-adhésive dans une boîte de Pétri (P60) de 60 mm de diamètre et étalez la solution dans un cercle de 3 à 5 cm de diamètre à l’aide d’une pointe de pipette.
   4. Laissez les plats P60 à découvert dans une hotte à flux laminaire et laissez sécher la solution (~30 min). Lavez la vaisselle 1x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2x avec de l’eau stérile. Laissez la vaisselle sécher à l’air libre dans une hotte à flux laminaire et rangez-la dans un sac en plastique scellé à 4 °C jusqu’à 1 mois.
2. Calibrez l’AFM et configurez un échantillon de cerveau dans l’AFM. REMARQUE : Suivez les instructions d’étalonnage AFM selon le fabricant.
   1. Chargez avec précaution une sonde AFM avec une constante de ressort nominale de 0,03 N/m et une bille de borosilicate de 20 μm de diamètre dans le support de sonde.
   2. Étalonnez la constante de ressort et la sensibilité du levier optique inverse (InvOLS) du cantilever AFM à l’aide de la méthode de réglage thermique.
      REMARQUE : Une fois que la constante de ressort d’une sonde AFM est calculée, elle doit rester constante en cas d’utilisation répétée. Cependant, l’InvOLS en porte-à-faux devra être recalibré à chaque fois que le laser sera réaligné avec le cantilever. De plus, l’étalonnage doit être effectué sur un substrat de plusieurs ordres de grandeur plus rigide que le cantilever, tel que le polystyrène.
   3. Allumez le chauffage monté sur la scène et réglez la température à 37 °C.
   4. Montez la tranche de cerveau sur les plats P60.
      1. Versez délicatement une tranche de cerveau de 350 m d’épaisseur et le milieu indépendant du dioxyde de carbone (CO₂}) du ballon à fond rond dans une parabole P60 recouverte d’un bioadhésif dérivé de la moule.
      2. Positionnez la tranche de cerveau au centre du plat P60 en l’inclinant doucement. Si nécessaire, pipetez lentement le milieu à partir d’une pipette manuelle pour déplier une tranche de cerveau qui s’est repliée sur elle-même, ou mieux encore, positionnez la tranche de cerveau au centre du plat.
      3. Retirez soigneusement l’excédent de média à l’aide d’une pipette P1000 (n’utilisez pas le vide).
      4. Placez un couvercle sur l’antenne P60 et laissez la tranche de cerveau adhérer pendant 20 min.
   5. Retirez la tête AFM, placez la tranche de cerveau montée dans la boîte P60 sur l’étage AFM et ajoutez ~2 ml de support indépendant indépendant du CO₂.
   6. Ajoutez soigneusement une goutte de média sur la sonde AFM pour la protéger contre la rupture due à la tension superficielle lorsqu’elle est abaissée dans le média entourant la tranche de cerveau.
   7. Repositionnez la tête AFM sur la platine et commencez à abaisser la tête jusqu’à ce qu’elle soit immergée dans le support.
   8. À l’aide de la caméra CCD (dispositif à couplage de charge (CCD) vue par le haut, repositionnez le laser sur le cantilever.
      REMARQUE : L’alignement du laser sur le cantilever aura légèrement changé en raison de la différence d’indice de réfraction de l’air et du milieu.
   9. Attendez 5 min que le porte-à-faux s’adapte à l’immersion dans un liquide chaud, puis réinitialisez l’alignement du miroir à une déviation libre de 0 V.
   10. Exécutez un spectre thermique sur la sonde AFM conformément aux instructions du fabricant. Utilisez l’ajustement du premier pic thermique pour recalculer l’InvOLS de la sonde AFM dans le milieu.
   11. À l’aide du microscope optique, déplacez la platine de l’échantillon de manière à ce que la région cérébrale d’intérêt se trouve sous la sonde AFM. REMARQUE : Le corps calleux apparaîtra sombre car il est plus opaque que la matière grise environnante. Le cortex est supérieur au corps calleux.
   12. Réinitialisez l’alignement du miroir à une déviation libre de 0 V.
   13. Sur le compteur de somme et de déflexion du logiciel AFM, cliquez sur « Engager » pour engager la tête AFM.
   14. À l’aide du cadran de position sur la tête AFM, abaissez la tête jusqu’à ce qu’un contact soit établi entre le cantilever et l’échantillon.
3. Effectuez des expériences de conformité fluulente.
   1. Construisez une fonction de force appliquée dans l’éditeur de fonctions du logiciel. La fonction de force consiste en une rampe de 0,1 seconde jusqu’à un point de consigne de 5 nN et en la maintenant pendant 20 secondes, suivie d’une rampe de 1 seconde jusqu’à une force appliquée de 0 nN.
      1. Sur le panneau principal d’indentation, sous la méthode d’indentation, sélectionnez « Charger » pour le mode Indenteur, « N » pour les unités et « Éditeur de fonction » pour la fonction Indentation.
      2. Dans l’éditeur de fonctions, dans le panneau Segment Parms, créez un segment de fonction de force appliquée qui commence à 0 nN et se termine à 5 nN, avec un temps de 0,1 seconde. Cliquez sur « Insérer --> ».
      3. Pour le segment suivant, réglez le début sur 5 nN, la fin sur 5 nN et le temps sur 20 s. Cliquez sur « Insérer --> ».
      4. Pour le dernier segment, réglez le début sur 5 nN, la fin sur 0 nN et la durée sur 1 s. Ensuite, cliquez sur « Dessiner » et fermez la fenêtre de l’éditeur de fonctions.
   2. Dans l’onglet Force du panneau principal, cochez « rampe d’entrée après le déclenchement » et réglez la fonction de force appliquée pour qu’elle se déclenche après avoir atteint un point de déclenchement de 0,1 V.
   3. Cliquez sur « Force unique » en bas de l’onglet Force du panneau principal, ce qui déclenchera la fonction de force construite-appliquée pour la conformité au fluage.
   4. Une fois l’indentation à force unique terminée, soulevez la tête AFM de manière à ce qu’elle ne soit pas en contact avec l’échantillon. Ensuite, réengagez la tête et remettez à zéro la déviation libre.
   5. Repositionnez l’étage d’échantillonnage pour localiser une nouvelle zone d’intérêt et abaissez la tête AFM pour établir le contact. REMARQUE : La tête AFM doit être rétractée de la surface de l’échantillon lorsque l’étage d’échantillonnage est déplacé. Le non-respect de cette consigne peut endommager le délicat porte-à-faux AFM.
   6. Répétez les étapes jusqu’à ce que la quantité de données souhaitée ait été collectée.
4. Mener des expériences de relaxation de force.
   1. Construisez une fonction d’indentation appliquée dans l’éditeur de fonctions du logiciel. La fonction d’indentation consiste en une rampe de 0,1 seconde jusqu’à un point de consigne de 3 μm et en la maintenant pendant 20 secondes, suivie d’une rampe de 1 seconde jusqu’à une profondeur d’indentation de 0 μm.
      1. Sur le panneau principal d’indentation, sous la méthode d’indentation, sélectionnez « Indentation » pour le mode Indenteur, « m » pour les unités et « Éditeur de fonctions » pour la fonction Indenter.
      2. Dans l’éditeur de fonctions, dans le panneau Segment Parms, créez un segment de fonction de force appliquée qui commence à 0 μm et se termine à 3 μm, avec un temps de 0,1 s. Cliquez sur « Insérer --> ».
      3. Pour le segment suivant, réglez le début sur 3 μm, la fin sur 3 μm et le temps sur 20 secondes. Cliquez sur « Insérer --> ».
      4. Pour le dernier segment, réglez le début sur 3 μm, la fin sur 0 μm et le temps sur 1 seconde. Cliquez ensuite sur « Dessiner » et fermez la fenêtre de l’éditeur de fonctions.
   2. Dans l’onglet Force du panneau principal, cochez « rampe d’entrée après le déclenchement » et réglez la fonction de force appliquée pour qu’elle se déclenche après avoir atteint un point de déclenchement de 0,1 V.
   3. Cliquez sur « Force unique » en bas de l’onglet Force du panneau principal pour déclencher la fonction d’indentation construite-appliquée pour la relaxation de la force.
   4. Une fois l’indentation à force unique terminée, soulevez la tête AFM de manière à ce qu’elle ne soit pas en contact avec l’échantillon, puis réengagez la tête et remettez à zéro la déviation.
   5. Repositionnez la platine pour localiser une nouvelle zone d’intérêt et baissez la tête pour établir le contact.
   6. Répétez les deux mesures jusqu’à ce que la quantité de données souhaitée ait été collectée.

Materials