Spectrométrie de masse plasma-plasma couplée par ablation laser inductive pour visualiser les métaux dans le tissu cérébral de souris

Résumé

Source : Hare, D. J., et.al. Imagerie des métaux dans le tissu cérébral par ablation laser - plasma à couplage inductif - spectrométrie de masse (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre l’utilisation de la spectrométrie de masse à plasma à couplage inductif par ablation laser (LA-ICP-MS) pour visualiser et quantifier les distributions de métaux dans le tissu cérébral de souris. Le protocole implique l’ablation laser pour générer un aérosol de particules d’échantillon, l’ionisation des particules dans un plasma à haute température et la spectrométrie de masse pour séparer les ions en fonction de leur rapport masse/charge. Un logiciel spécialisé est ensuite utilisé pour générer des images quantitatives, révélant la distribution spatiale des métaux au sein du tissu.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation de la LA-ICP-MS pour l’analyse

1. Placez les étalons et l’échantillon dans la chambre d’ablation, en vous assurant qu’ils se trouvent dans la profondeur de champ de la caméra CCD installée sur l’unité LA. Si un accord de l’instrument est nécessaire, incluez un matériau de référence approprié ( par exemple, NIST 612 Trace Elements in Glass). Serrez à la main les deux vis sur la porte de la chambre pour sceller la chambre d’ablation.
2. Dans le logiciel ICP-MS, sélectionnez ouvrir la vanne de gaz argon dans le panneau « Maintenance » ou un panneau similaire et réglez le débit de gaz porteur sur 1,2 L min^-1 dans la boîte de dialogue appropriée.
   NOTE : Dans ce protocole, l’argon est utilisé comme gaz vecteur. Plusieurs exemples utilisent soit de l’hélium, soit un mélange d’hélium et d’argon comme gaz vecteur.
3. Dans le logiciel LA, cliquez sur le bouton 'purge' pour rincer la cellule avec du gaz argon pendant au moins 30 min.
   REMARQUE : Le temps de purge peut être modifié en cliquant sur un bouton 'temps de purge' ou similaire. Lorsque vous utilisez un système d’ablation avec une cellule d’ablation à deux volumes, déplacez périodiquement la platine vers chaque coin et traversez la cellule en diagonale pour vous assurer que le plus d’air résiduel possible est évacué de la cellule. Cela peut être réalisé en sélectionnant la fonction « étapes d’origine » ou une fonction équivalente.
4. Allumez l’ICP-MS en cliquant sur « plasma activé » et laissez-le se réchauffer pendant deux heures, au cours desquelles les étapes 1.5 à 2.4 peuvent être effectuées. Les réglages de l’instrument varient d’un fabricant à l’autre.
5. Ablation représentative des étalons tissulaires
   1. Sélectionnez l’outil de ligne et tracez une seule ligne d’ablation d’environ 3 mm de long sur la surface du tissu.
   2. Réglez les paramètres comme suit en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la ligne d’ablation dans la liste des expériences et en modifiant les éléments suivants : diamètre du faisceau (sélectionné selon les besoins de l’utilisateur ; un faisceau carré de 30 μm est utilisé ici), vitesse de balayage (4 fois le diamètre du faisceau par seconde ; 120 μm s^-1) et fluence d’énergie (0,3 -0,5 J cm^-2 pour les tissus mous ; optimiser si nécessaire pour les matrices plus dures). À une épaisseur de tissu de 30 μm, le faisceau laser ne pénètre pas toute l’épaisseur de ce tissu, éliminant ainsi tout contaminant potentiel du support du microscope. La normalisation en carbone peut être utilisée pour corriger la variation de la quantité de tissu ablaté. Définissez ces paramètres par défaut pour chaque ligne suivante en sélectionnant la case d’option « par défaut ».
   3. Dupliquez cette ligne six fois en sélectionnant la ligne initiale, en cliquant avec le bouton droit de la souris et en sélectionnant « Duplicate scans ». Assurez-vous que les lignes sont décalées dans l’axe x- ou y- par le diamètre du faisceau. Cela donne un total de sept lignes par étalon, espacées en fonction du diamètre du faisceau.
   4. Répétez les étapes 1.5.1 à 1.5.3 pour chaque étalon, en veillant à ce que la ligne soit de longueur identique.
6. Pour dessiner la zone d’ablation sur l’échantillon, suivez l’une des deux méthodes suivantes :
   REMARQUE : Assurez-vous que les mêmes paramètres de balayage (diamètre du faisceau, vitesse de balayage, fluence d’énergie) sont utilisés pour les lignes d’échantillonnage.
   1. Si le système LA est équipé d’un large champ de vision, sélectionnez l’outil linéaire et tracez une ligne à partir du coin supérieur gauche de l’échantillon suffisamment longue pour couvrir l’échantillon à son point le plus large en utilisant les mêmes paramètres laser décrits à la section 1.5. Dupliquez ce balayage comme indiqué à la section 1.5.3 avec des lignes espacées en fonction du diamètre du faisceau autant de fois que nécessaire pour assurer une couverture complète de l’échantillon.
   2. Si une vue à grand champ n’est pas disponible, déterminez et enregistrez les coordonnées x et y (généralement affichées sur l’écran principal comme 'position de la scène' ou similaire) correspondant aux coins d’un rectangle couvrant l’ensemble de l’échantillon. Utilisez ces coordonnées pour positionner des lignes d’ablation parallèles couvrant toute la surface de l’échantillon.
   3. Tracer des lignes pour le balayage intermittent des étalons au plus tard après ~20 h de balayage de l’échantillon en répétant le processus décrit au point 1.5. En fonction de la durée de balayage de l’échantillon, cela peut être nécessaire plusieurs fois. Terminez l’expérience par un balayage supplémentaire des normes.
      REMARQUE : Lors de la détermination des coordonnées x et y pendant que la cellule est en cours de purge, la sélection des positions d’origine et le calibrage associé de l’axe modifiera les spécificités précédemment acquises pour les coordonnées x et y tandis que la différence (c’est-à-dire la longueur de la ligne) ne sera pas affectée.

2. Configuration des méthodes d’acquisition de données pour l’ICP-MS

1. Pour la ligne d’ablation standard, divisez la longueur de la ligne par la vitesse de balayage laser pour déterminer le temps total d’analyse d’une seule ligne. Répétez cette opération pour l’échantillon.
2. Dans le logiciel ICP-MS, créez une nouvelle méthode (illustrée ici sous la forme d’un « lot ») et assurez-vous que l’option « analyse résolue en temps » ou équivalente est sélectionnée. Sélectionnez les valeurs m/z à détecter, puis ajustez le temps d’intégration pour chaque m/z de sorte que le temps d’intégration total d’un cycle soit égal à 0,25 s. Cliquez sur « Enregistrer le lot sous » et nommez en conséquence (par exemple, Std1).
   REMARQUE : Comme l’échantillon traversera le faisceau laser à quatre fois le diamètre du faisceau, cela garantit qu’un point de données pour chaque masse est enregistré équivalent au diamètre du faisceau. Par exemple, en utilisant une taille de spot de 100 μm, une vitesse de balayage de 400 μm s^-1 avec un temps d’intégration de 0,25 s produira des images avec des tailles de pixels réelles. Le temps d’intégration peut être ajusté pour améliorer la sensibilité ; Lors de l’augmentation du temps d’intégration à 0,33 s, la vitesse de balayage doit être ralentie à trois fois le diamètre du faisceau.
3. Pour les normes, entrez le temps d’analyse pour chaque balayage de ligne dans la case appropriée, plus 15 s supplémentaires pour tenir compte des temps de préchauffage et de lavage du laser. Entrez une liste d’exemples d’exécutions (, c’est-à-dire , l’ordre dans lequel les analyses sont exécutées) avec le même nombre d’acquisitions (généralement numérotées séquentiellement ; c’est-à-dire 001, 002, etc.) comme le nombre total de lignes standard.
4. Pour l’échantillon, dupliquez la méthode utilisée pour les étalons en enregistrant la méthode ou le lot actuel sous un autre nom de fichier, et ajustez le temps d’acquisition total (y compris les 15 s supplémentaires) et le nombre total d’acquisitions pour correspondre au nombre de lignes qui permettront d’ablater l’échantillon.
   REMARQUE : Comme la plupart des systèmes LA-ICP-MS utilisent un déclencheur unidirectionnel (LA déclenche ICP-MS), il est essentiel que le logiciel ICP-MS attende le déclencheur de l’AL avant que la ligne d’ablation suivante ne commence. La fenêtre d’acquisition ICP-MS indiquera « en attente de démarrage ».

3. Exécution de l’expérience

1. Démarrez la file d’attente ICP-MS en ajoutant la première méthode ou le premier lot à la file d’attente et assurez-vous que le logiciel attend le déclenchement du système LA.
2. Dans le logiciel LA, activez l’alimentation laser en cliquant sur « émission », cliquez sur « exécuter » et réglez le temps de préchauffage du laser sur 10 s et le temps de lavage sur 20 s dans les cases appropriées.
   REMARQUE : Ce dépassement garantira que l’ICP-MS est prêt à commencer à acquérir de nouvelles données lorsque le laser commence chaque ligne d’ablation suivante.
3. Démarrez la séquence laser en cliquant sur « démarrer ». Si vous utilisez une cellule à deux volumes, assurez-vous que le gobelet d’échantillon est en place.

4. Calcul des normes de quantification

REMARQUE : Il existe de multiples variantes pour convertir les données ICP-MS en images. Il s’agit notamment de l’utilisation d’outils logiciels faits maison écrits dans des langages open-source, de macros commerciales et de logiciels d’analyse de données. Ici, utilisez le plugin logiciel récemment développé, basé sur une suite spécialisée d’analyse de données LA-ICP-MS.

1. Transférez tous les dossiers de lots contenant les données d’exécution (001.d, 002.d, etc.) sur un ordinateur séparé sur lequel le logiciel d’analyse est installé. Extrayez les fichiers de données *.csv pour chaque ligne du lot dans un dossier distinct.
   NOTE : Il est fortement recommandé d’utiliser un script pour transférer automatiquement les fichiers *.csv dans un nouveau dossier. Voir le code Python ci-joint pour plus de détails. Ce script a été écrit pour s’adapter à un ICP-MS Agilent série 7700 ou 8800, mais peut être modifié pour s’adapter au fichier de sortie d’autres fabricants.
2. Ouvrez la plateforme logicielle et suivez les onglets séquentiellement pour importer et analyser les normes afin de produire des images quantitatives comme décrit ci-dessous.
3. Pour importer les données du premier lot standard, sélectionnez 'Agilent .csv' pour 'Type de fichier', 'Dossier entier' pour 'Type d’importation' et vérifiez que le 'Format de date' est identique au format de l’ordinateur. Cliquez sur 'Importer', sélectionnez le dossier contenant les fichiers .csv pour le premier ensemble de normes, puis passez à l’onglet 'Lignes de base'.
4. Baseline subtraction
   1. Utilisez l’onglet 'Sélections automatiques' (commande 2) dans le menu déroulant de l’application principale de la barre d’outils, sélectionnez 'Informations provenant de l’importation' et cliquez sur 'Continuer'.
   2. Cliquez sur « Tout sélectionner » et sélectionnez « Baseline_1 » pour l’intégration.
   3. Pour sélectionner les 10 premières secondes de chaque ligne de balayage (correspondant au temps de préchauffage du laser), recadrez les données en saisissant les secondes valeurs '0' et '(durée de la ligne - 10 s)' et cliquez sur 'Ajouter des intégrations' (par exemple, pour une ligne de balayage de 35 secondes, entrez les valeurs '0' et '25').
5. Pour sélectionner les données d’échantillon, utilisez l’onglet « Sélections automatiques » comme décrit dans la section 4.4, mais choisissez « Output_1 » comme intégration. Recadrez les données du début et de la fin de chaque ligne standard pour exclure le signal d’arrière-plan (, par exemple pour une ligne de balayage de 35 s, entrez les valeurs '13' et '4').
6. Pour exclure les baisses de signal causées par d’éventuels trous dans les normes, dans l’onglet 'Échantillons', cliquez sur 'Canaux' en haut à gauche de la zone du graphique pour sélectionner un canal avec un rapport signal/bruit élevé (par exemple, C13 ou P31). Notez les baisses brutales du signal et sélectionnez une valeur CPS suffisamment basse qui est inférieure à la variation normale dans les échantillons, mais suffisamment élevée pour repérer les baisses brutales du signal.
7. Cliquez sur l’onglet « DRS » et sélectionnez « Baseline_Subtract » pour le « Programme actuel de réduction des données ». Choisissez le canal 4.6 pour 'Canal d’index' et la valeur CPS pour 'Seuil à utiliser lors du masquage des signaux faibles'. Insérez une valeur <0,5 s pour 'Secondes pour couper avant/après les signaux faibles' pour tenir compte du retard dans le transfert du signal du laser vers l’ICP-MS.
8. Pour confirmer le masquage adéquat des zones de signal faible, cliquez de nouveau sur l’onglet 'Échantillons' et sélectionnez une trace de canal traitée (e.g., Fe56_CPS). Répétez et affinez les valeurs CPS et 'Secondes pour couper avant/après les signaux faibles' comme dans 4.7 si nécessaire.
9. Cliquez sur l’onglet « Résultats » et choisissez « Exporter les données » dans le menu déroulant principal de l’application. Entrez un nom de fichier pour générer un fichier de données de tableur des résultats (e.g., calculs Std1, Std2...).
10. Ouvrez le fichier de données dans un tableur approprié et calculez les valeurs CPS pour chaque canal individuel à quantifier. À l’aide des concentrations métalliques prédéterminées de la nébulisation en solution, ICP-MS, pour calculer le facteur de conversion des valeurs CPS en ppm (μg g⁻¹) pour chaque élément quantifiable.
11. Répétez les étapes 4.3 à 4.10 pour tous les ensembles de normes de la série.

5. Construction d’images quantitatives

1. Écrivez 'Biolite()' dans l’invite de commande pour ouvrir le logiciel.
2. Importez les données d’exemple en cliquant sur « Charger les images » et en sélectionnant le dossier contenant les fichiers .csv pour l’image d’exemple.
3. Correction d’arrière-plan
   1. Cliquez sur l’onglet 'Lignes de base' pour appliquer une correction d’arrière-plan à l’échantillon. Sur l’image phosphore (P31) affichée à l’écran, sélectionnez des zones de l’arrière-plan à l’aide de l’outil de dessin rectangulaire. La sélection d’autant de régions que possible crée une carte à l’échelle de l’image de la dérive du signal/plasma afin d’assurer une compensation adéquate de ces facteurs de confusion.
   2. Pour rendre le signal d’arrière-plan plus visible, sélectionnez l’outil d’édition de graphique (en haut à gauche de l’image affichée) et cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image. Sélectionnez 'Modifier l’apparence de l’image' et changez la 'Première couleur à Z=' en une grande valeur négative (par exemple -100 000). Continuez en cliquant sur « Terminé ».
4. Cliquez sur l’onglet « Normes » pour afficher un tableau des facteurs de correction CPS/ppm. Entrez les valeurs calculées à partir des normes à l’étape 4.10 pour chacun des éléments. Cette étape aidera à corriger la dérive de sensibilité dans l’ICP-MS. Cliquez sur « Aller ! »
5. Ouvrez « Navigateur de données » à partir de l’onglet « Données », qui contient les images de chaque élément et de chaque étape.
6. Pour finaliser une image à exporter, sélectionnez l’image souhaitée dans le dossier 'StdCorrImages', cliquez avec le bouton droit de la souris sur le nom de l’image (*_ppm) et cliquez sur 'NewImage'. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’image pour ouvrir « Modifier l’apparence de l’image » afin de choisir la table de couleurs et l’échelle de couleurs souhaitées. Ajoutez une échelle de couleurs à l’image en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image et en sélectionnant « Ajouter une annotation ». Sélectionnez « ColorScale » dans le menu déroulant en haut à gauche et utilisez les onglets pour modifier l’échelle de couleurs souhaitée.
7. Pour exporter une image, assurez-vous que l’image en question est sélectionnée et accédez à l’onglet « Fichier » et cliquez sur « Enregistrer les graphiques... ». Sélectionnez le format souhaité et enregistrez l’image. Alternativement, l’image sélectionnée peut être transférée à l’aide des outils de copier-coller.
8. Répétez les étapes 5.6 et 5.7 pour toutes les images qui vous intéressent.
9. Quantification de régions discrètes
   1. Pour activer les outils de retour sur investissement, accédez à l’onglet 'Analyse', 'Packages' et sélectionnez 'Traitement d’image'.
   2. Sélectionnez l’image souhaitée et accédez à l’onglet « Image » et cliquez sur « ROI... ». Cliquez sur « Démarrer le dessin du retour sur investissement » et utilisez un outil de dessin pour sélectionner une région d’intérêt dans l’échantillon. Pour terminer le dessin, cliquez sur « Terminer le retour sur investissement ».
   3. Pour acquérir les statistiques du retour sur investissement sélectionné, accédez à l’onglet « Image » et cliquez sur « Statistiques...
   4. Copiez et collez les résultats dans une feuille de calcul distincte. Répétez la sélection du retour d’intérêt (5.9.2) pour toutes les régions et tous les éléments d’intérêt.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lames de microscope en verre soda	n/a	n/a	Les lames typiques conviennent à toutes les expériences
NWR213 Système d’ablation laser	ESI Ltd	n/a	Utilisé dans ces expériences. D’autres fabricants appropriés, peuvent nécessiter des modifications du protocole
Agilent 8800 Series ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Utilisé dans ces expériences. D’autres fabricants appropriés, peuvent nécessiter des modifications au protocole
Iolite	Iolite Software	n/a	Disponible à partir de http://iolite-software.com/. D’autres méthodes sont disponibles, voir protocole
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Disponible à partir de https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm