Imagerie par bioluminescence pour évaluer la croissance tumorale dans une tranche de cerveau de souris organotypique

Résumé

Source : Ciraku, L., et. al. Un modèle ex vivo de tranche de cerveau pour étudier et cibler la croissance tumorale métastatique du cancer du sein. J. vis. exp. (2021).

Cette vidéo démontre l’imagerie de cellules tumorales exprimant la luciférase dans une tranche de cerveau de souris organotypique. La luciférine est ajoutée au milieu et la plaque est placée à l’intérieur de la chambre du système d’imagerie in vivo. Les paramètres de capture d’image sont ajustés et la forme et la taille de la tumeur sont définies. Les signaux bioluminescents émis par les cellules tumorales sont ensuite enregistrés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

Remarque : Des souris femelles athymiques Nu/Nu (âgées de 6 à 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.

1. Injection intracrânienne de cellules tumorales

1. Stérilisez tout le matériel (pince à épiler, ciseaux, ciseaux de suture, perceuse à main) sous un cycle de séchage d’un autoclave pendant jusqu’à 45 minutes dans des poches de stérilisation, y compris un indicateur de stérilisation. Si les chirurgies sont pratiquées sur plusieurs animaux, stérilisez les outils entre les animaux à l’aide d’un stérilisateur à billes chauffées (jusqu’à 3x).
2. Anesthésier les souris selon le protocole de soins aux animaux des utilisateurs (p. ex., isoflurane (4 % pour l’induction, 1 à 2 % pour l’entretien) et administrer l’analgésie (sous-cutanée, 0,1 mL de buprénorphine 0,1 mg/kg de buprénorphine SR-LAB) avant le début de la chirurgie. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie optimale en pinçant les orteils.
3. Placez les souris dans un cadre stéréotaxique et immobilisez la tête à l’aide de barres d’oreille standard (Figure 1A). Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
4. Stériliser la surface de la tête en appliquant alternativement (3x) des tampons d’iode et de l’éthanol à 70 % avant l’incision.
5. À l’aide d’un scalpel chirurgical, faites une incision médiane de 1 cm à travers la peau à un angle légèrement diagonal par rapport à la ligne imaginaire qui divise le cerveau de la souris en deux moitiés symétriques pour exposer le crâne. Essuyez le sang avec un coton-tige.
6. Dévier la peau latéralement pour exposer le site d’injection : 2 mm à droite, 1 mm en avant en référence au petit déjeuner +2 médiolatéral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
7. Utilisez une fraise (0,73 mm) pour pénétrer dans le crâne +2ML, +1RC dans le bregma et percez un trou en utilisant une légère pression et un mouvement de torsion.
8. À l’aide d’une seringue d’injection cérébrale, injectez 5 μL d’une solution de 100 000 cellules MDA-MB-231BR (exprimant de manière stable la protéine fluorescente verte ou GFP-Luciférase) par μL dans une solution saline tampon de phosphate stérile (PBS) en insérant initialement la seringue à 3,5 mm de profondeur dans le cerveau.
9. Laissez la seringue reposer pendant 2 min. Tirez-la vers le haut d’environ 1 mm, et après 2 min, injectez lentement la première moitié du volume.
10. Attendez encore 2 minutes avant d’injecter le reste, puis tirez lentement sur la seringue 3 minutes après l’injection finale. note: L’injection lente est empirique en ce sens qu’elle permet au volume d’être bien absorbé par le tissu cérébral et de ne pas créer de fuite après avoir tiré la seringue, ce qui peut entraîner la croissance de cellules cancéreuses en dehors du site prévu.
11. Appliquez de la cire osseuse sur le site d’injection sur le crâne, puis utilisez des sutures en polypropylène pour suturer le tissu. Les souris se rétabliront dans les 5 minutes suivant le retrait de l’anesthésie.
12. Surveillez leur comportement juste après l’opération pendant environ 10 minutes, 3 heures plus tard et le lendemain pour déterminer si un traitement spécial, y compris une injection de solution saline, des aliments mous, etc., est nécessaire pour aider à une récupération rapide.
13. Surveillez la croissance tumorale via l’imagerie par bioluminescence sur le système d’imagerie.
    1. Pour cela, activez d’abord l’oxygène et l’isoflurane dans le système d’imagerie. Laissez les deux être distribués dans une chambre séparée à l’extérieur de la boîte d’imagerie.
    2. Ensuite, allumez le logiciel, initialisez l’instrument et choisissez l’option appropriée pour visualiser et capturer l’ensemble du corps de la souris.
14. Placez les souris dans une chambre séparée avec de l’isoflurane et assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie optimale avec un pincement des orteils. Injectez aux souris par voie intrapéritonéale 200 μL de luciférine à 30 mg/mL.
15. Transférez l’estomac de la souris vers le bas-nez de la chambre d’imagerie alimenté en oxygène et en isoflurane. Verrouillez la chambre et choisissez une exposition de 2 minutes pour commencer l’imagerie.
16. Utilisez l’outil ROI (région d’intérêt) du logiciel pour quantifier le signal bioluminescent de la tumeur.
17. Pour analyser la taille de la tumeur, choisissez l’outil en forme de cercle pour l’adapter à la forme et à la taille de la tumeur. Mesurez le retour sur investissement et rapportez les relevés totaux.
18. Laisser la croissance tumorale solide pendant 12 à 14 jours (ou jusqu’à ce que la luciférase atteigne environ 7,0 x 10⁶ unités) (Figure 1B) avant de générer des tranches de cerveau. note: L’augmentation du nombre de cellules à injecter entraînera une croissance tumorale plus rapide ; Par conséquent, la génération de coupes de cerveau peut se produire avant 12 jours. D’autre part, une tumeur plus grosse entraînera plus de tranches de GFP+ si on la laisse se développer pendant 14 jours. Après 14 jours, la santé des souris commence à se détériorer rapidement ; Par conséquent, la surveillance de la santé animale doit être augmentée à une fois par jour après le point de temps de 10 jours, et toute souris présentant des signes de douleur et/ou d’inconfort doit être utilisée pour générer les tranches.

2. Générer des tranches de cerveau

REMARQUE : Effectuez les étapes après l’isolement du cerveau dans une hotte à flux laminaire stérile. Il est généralement possible de générer 35 à 40 coupes individuelles contenant des cellules tumorales (signal luciférase) à partir d’une souris injectée avec des cellules MDA-MB-231BR (Figure 1C).

1. Stérilisez tous les outils chirurgicaux dans un autoclave. Placez la trancheuse de tissus dans la hotte stérile à flux laminaire et nettoyez tous les outils et instruments avec de l’éthanol à 70 %.
2. Après 12 à 14 jours après l’injection intracrânienne de cellules MDA-MB-231BR, anesthésier les souris selon le protocole de soins aux animaux de l’utilisateur, tel que décrit en 1.2. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie optimale en pinçant les orteils.
3. Prélever et placer rapidement leur cerveau (dans un délai de 45 s) dans du saccharose artificiel (4 °C) ou du saccharose-ACSF composé des éléments suivants : 280 mM de saccharose, 5 mM de chlorure de potassium (KCl), 2 mM de chlorure de magnésium (MgCl₂), 1 mM de chlorure de calcium (CaCl₂), 20 mM de glucose, 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinethanesulfonique ou HEPES, 5 mM d’ascorbate de sodium (Na+), 3 mM de thiourée, 2 mM de Na+, 29 mM de pyruvate ; pH = 7,3.
4. À l’aide d’un scalpel ou d’une lame de rasoir tranchant et stérile, coupez les parties en excès du cerveau qui ne contiennent aucune tumeur de tous les côtés, y compris la partie inférieure du cerveau.
5. Amenez la forme du cerveau à un cube imparfait pour l’asseoir à plat sur le papier filtre mouillé à l’ACSF sur un couvercle de plat de 60 mm pour faciliter le tranchage. note: Le tissu supplémentaire du cerveau où il est peu probable que la tumeur se soit développée est retiré avant le tranchage pour permettre la génération de tranches principalement GFP+ et créer une forme du cerveau stable à la surface de l’instrument et qui ne sera pas perturbée par les vibrations causées par le tranchage.
6. Placez plusieurs feuilles de cercles de papier filtre pré-mouillés (avec ACSF) sur la plate-forme de coupe et placez le tissu bloqué par-dessus.
7. Réglez la taille de coupe de l’instrument sur 2 ou 2,5 unités sur la règle fournie pour couper le tissu en sections de 200 à 250 μm. note: Des tranches allant jusqu’à 350 μm ou aussi fines que 100 μm sont viables. Pour les tranches < 200 μm, utilisez un vibratome ou un compresstome.
8. À l’aide d’un pinceau (zibeline), transvaser des tranches de cerveau dans une boîte contenant du saccharose ACSF et séparer les tranches au microscope optique à l’aide d’aiguilles de 27 G.
9. Identifiez les coupes positives à la GFP au microscope fluorescent et transférez-les dans une nouvelle boîte de 60 mm contenant 2 à 3 ml de milieu de coupe adulte (milieu neurobasal A, supplément de 2 % de B12, supplément de 1 % de N2, 1 % de glutamine, 0,5 % de glucose, 10 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine) à l’aide d’une pipette stérile de 1 mL (large ouverture). note: Les tranches de cerveau qui contiennent des cellules tumorales se développant à la surface du cerveau (peut-être en raison d’une fuite de cellules d’injection, etc.) sont exclues.
10. Transférez 3 à 5 tranches sur chaque insert de culture tissulaire de 30 mm de taille de pores de 0,4 μm dans des plaques de 6 puits à une distance qui ne permet pas de les croiser les unes dans les autres.
11. Retirez l’excédent de milieu de la surface de l’insert à l’aide d’une pipette P1000, ajoutez 1 ml de milieu de tranche de souris adulte sous chaque insert et équilibrez le milieu dans l’incubateur avant de trancher.
12. Incuber les tissus à 37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité pendant 24 h avant l’imagerie.

3. Imagerie par système d’imagerie in vivo (IVIS) des coupes

REMARQUE : Effectuez les étapes d’ajout de luciférase et d’inhibiteur dans une hotte à flux laminaire stérile.

1. Pipeter 5 μL de solution de luciférine à 30 mg/mL dans le milieu sous les inserts en soulevant l’insert à l’aide d’une pince et en les replaçant dans le puits après avoir ajouté de la luciférine au milieu dans le puits.
2. Placez la plaque à 6 puits avec le couvercle à l’intérieur de la chambre d’imagerie de l’instrument sous la caméra fixe et verrouillez la porte de la chambre.
3. Ouvrez le logiciel et initialisez l’instrument.
4. Choisissez les paramètres de l’appareil photo qui permettent de visualiser et de capturer un seul puits par image. Déplacez la platine vers le haut (champ de vision ou FOV de 5 cm) et placez le puits qui doit être imagé directement sous la caméra.
5. Réglez le temps d’imagerie sur le plus approprié en fonction de l’intensité de la luciférase que la tumeur émettra, qui peut varier de 10 s à 5 min. Commencez par le régler sur 10 s, puis augmentez si le signal est faible, mais maintenez-le cohérent pour tous les points et conditions de temps jusqu’à la fin de l’expérience (Figure 1D).
6. Utilisez l’outil ROI (outil en forme de cercle), adaptez-le à la forme et à la taille de la tumeur, mesurez le ROI et rapportez les lectures totales pour quantifier le signal bioluminescent de chaque tumeur sur la tranche.

Résultats

Graphique 1. Injection intracrânienne, génération de tranches de cerveau et croissance de BCBM ex vivo. (A) Représentation schématique d’une souris lors d’une injection intracrânienne sous un instrument stéréotaxique. (B) Images représentat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 mL seringue, embout coulissant	BD	309659
30 G1/2 Aiguilles	BD	305106
plaques à 6 puits	Genessee	25-105
Microscope automatisé et logiciel LUMAVIEW	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Bécher 50 mL	Fisher	10-210-685
Pinceau zibeline émoussée, Taille #5/0	Microscopie électronique Sciences	66100-50
Cire d’os	ModoMed	DYNJBW25
Seringue d’injection cérébrale	Hamilton Company	80430
CaCl₂Fisher	Scientific	BP510-250
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Lame de rasoir à double tranchant	VWR	55411-060(95-0043)
Papier filtre , cercles quantitatifs, 4,25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Pinceau zibeline fine #2/0	Microscopie électronique Sciences	66100-20
Forceps	Outils de sciences fines	11251-20
Glucose	Sigma Aldrich	G8270
Glutamine (200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
Set de perceuse à main avec micro mini forets hélicoïdaux	Amazon	YCQ2851920086082DJ
HEPES, acide libre	Fisher Scientific	BP299-1
Juste pour souris Cadre stéréotaxique	Appareil de Harvard (Holliston, MA, USA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Grands ciseaux chirurgicaux	Outils de science fine	14001-18
Cellules MDA-MB-231BR	Aimablement fourni par Dr. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
Appareil d’imagerie des souris	Système Perkin Elmer	IVIS 200 Logiciel
d’imagerie de souris	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, États-Unis).		d’image vivante
Lecteur de microplaques	Tecan
Spark Solution de montage	Invitrogen	P36935
Réactif MTS	Promega CellTiter 96 Solution aqueuse unique	(Cat :G3582)
N2 supplément	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Technologies	21103049
souris athymiques Nu/Nu	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldéhyde	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Suture en polypropylène	Medex supply	ETH-8556H
Povidone Écouvillon d’iode bâtons	DME Supply USA	Cat : 689286X
Lame de scalpel #11 (paquet de 100)	Fine Science Tools	10011-00
Manche de scalpel #3	Fine Science Tools	10003-12
Sodium Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Spatule/sonde	Fine Science Tools	10090-13
SS Lames de rasoir non revêtues à double tranchant (American safety razor co (95-0043))	VWR	55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Scalpel chirurgical	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(type McIlwain)
Inserts de culture tissulaire	Millipore	PICMORG50 ou PICM03050

Logiciel