Imagerie de génération de secondes harmoniques dans un modèle de rat pour étudier les défauts de la tubuline

Résumé

Source : Piazza, V., et al., Optique non linéaire sans marquage pour l’étude des défauts dépendants de la tubuline dans la myéline centrale. J. Vis. Exp. (2023)

Cette vidéo montre la procédure d’imagerie des anomalies des microtubules dans une tranche de tissu cérébral de rat à l’aide d’un microscope à excitation à deux photons. Il utilise des signaux de génération de seconde harmonique (SHG) pour détecter les défauts de la tubuline et la production réduite de myéline.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Transférez au microscope

1. Si le microscope se trouve dans une autre pièce, préparez une boîte isotherme avec des packs de gel réchauffés pour transférer les sections de tissu tout en maintenant la température. La boîte gardera également les sections au chaud jusqu’à ce qu’elles soient imagées.
2. Placez l’échantillon sous le microscope et assurez-vous qu’il est correctement positionné sous l’objectif par observation directe à travers les oculaires avec lumière transmise.
   REMARQUE : L’objectif est d’aligner les structures émettrices prédites avec la direction d’oscillation du laser afin de maximiser le signal de seconde génération d’harmoniques (SHG) émis (et donc détecté).
3. Retirez l’excès de HBSS de sorte qu’une fine pellicule liquide recouvre l’ensemble de l’échantillon. Vérifiez visuellement le film liquide toutes les quelques minutes pour éviter une évaporation et un séchage excessifs de l’échantillon.
   REMARQUE : Dans les conditions décrites, une section n’est pas utilisée plus de 20 min. Le séchage de l’échantillon provoque des effets artificiels drastiques (Figure 1A). Si des temps d’imagerie plus longs sont nécessaires, il est recommandé de tremper périodiquement la section dans un milieu chaud et frais plutôt que d’ajouter plus de HBSS. L’utilisation de chambres de perfusion et de colle ou d’agarose à bas point de fusion pour immobiliser le tissu est également recommandée lorsque des expériences plus longues doivent être effectuées.
4. Préparez la platine du microscope pour l’imagerie sans balayage, ce qui peut inclure la fermeture de toutes les portes de la chambre d’incubation sombre ou la couverture de la chambre d’incubation avec un tissu enduit de nylon noir enduit de polyuréthane.

2. Imagerie

1. Sélectionnez le mode d’imagerie « non dénumérisé » le long du chemin de transmission. De cette façon, la capture du signal SH faible de la tubuline sera optimisée.
2. Sélectionnez l’objectif LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 NA.
3. Réglez une puissance laser comprise entre 13 mW et 26 mW, avec un temps de séjour des pixels de 12,6 μs. Prenez des images ne dépassant pas 512 pixels x 512 pixels, avec une vitesse de 5 et une moyenne de 2, pour un temps d’acquisition moyen d’environ 15 s.
   REMARQUE : L’utilisation de puissances laser plus élevées et/ou de temps de séjour plus longs peut endommager l’échantillon (Figure 1B).
4. Prenez d’abord des images à l’aide d’un filtre passe-court de 485 nm (SP485) et, dans un deuxième temps, ajoutez un filtre passe-bande de 405 nm (BP405 ; Figure 2).
   NOTE : Les images en pseudo-fond clair peuvent être prises à travers le même détecteur en utilisant la lumière laser résiduelle d’une ligne visible (les lasers de 405 nm ou 488 nm fonctionnent mieux).

Résultats

Figure 1 : Exemples d’artefacts. (A) Artéfact dû au séchage de l’échantillon. (B) Artéfact dû à une exposition excessive. Barres d’échelle : 30 μm.

Matériaux