Imagerie confocale en accéléré de la dynamique dendritique neuronale dans des explants rétiniens de souris

Résumé

Source : Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage de virus adéno-associés clairsemés de populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre l’utilisation de la microscopie confocale pour visualiser la dynamique dendritique dans des explants rétiniens de souris vivantes. Il décrit les étapes de stabilisation de la rétine au microscope confocal, d’imagerie par épifluorescence pour visualiser les interneurones amacrines en étoile et de capture d’images 3D en accéléré pour surveiller les changements dans la morphologie dendritique amacrine.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Imagerie confocale en accéléré de préparations de rétine entières en direct

1. Assemblez la chambre d’incubation d’imagerie en direct pour un microscope confocal droit, comme on le voit dans Figure 1.
   REMARQUE : Pour les systèmes confocaux inversés, les montages plats sont placés les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) côté bas directement sur la lamelle inférieure en verre de la chambre d’incubation. Une fois que les rétines entrent en contact avec la lamelle, elles ne peuvent pas être déplacées.
2. Remplissez la chambre de liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné (aCSF) et allumez la pompe et le régulateur de température (température 32-34 °C, débit 1 mL/min). Ne laissez pas la température dépasser 34 °C.
3. Pour transférer le rétinien à montage plat dans la chambre de perfusion, arrêtez la pompe et retirez l’aCSF qui se trouve dans la chambre. Placez le disque d’ester de cellulose mixte (MCE) avec le support plat rétinien dans la chambre d’incubation (vide).
4. Placez un poids d’échantillon sur le support plat ; Pré-mouillez le poids pour briser la tension superficielle. Remplissez la chambre avec l’aCSF réchauffé et faites circuler l’aCSF à ~1 mL/min.
5. Positionnez la tourelle porte-objectifs avec l’objectif d’immersion dans l’eau 25x (ouverture numérique 0,95) dans la chambre d’imagerie. Dépistage des cellules d’intérêt marquées à l’aide d’une lumière épifluorescente (Figure 1C).
6. Ajustez le volume d’imagerie pour capturer les caractéristiques dendritiques d’intérêt.
   REMARQUE : Cette étude a capturé l’arbre dendritique complet à 1024 x 1024 pixels par image, pas z 1 μm et une fréquence d’images de 2 min entre chaque pile z. Les tailles d’image finales sont de ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Pour régler la puissance laser à un réglage optimal, utilisez une table de recherche qui identifie à la fois les pixels sursaturés et sous-saturés. Pendant le balayage, ajustez la puissance du laser de manière à ce qu’aucun pixel ne soit sursaturé (c’est-à-dire à une intensité de 255 ou plus). Continuez l’imagerie aussi longtemps que nécessaire ou jusqu’à ce qu’il y ait une baisse significative et détectable du signal fluorescent et une augmentation du bruit (généralement 2 à 4 h).
   NOTE : Une puissance laser réduite est recommandée car les algorithmes de déconvolution fonctionnent de manière optimale lorsque les pixels sont répartis sur toute la plage dynamique. L’intensité des pixels ne doit pas dépasser 254 ; Des analyses empiriques de neurites ont révélé que des valeurs de pixels inférieures à 170 sont idéales pour la déconvolution. Des vitesses de balayage rapides (400-600 Hz) avec une moyenne de ligne (2-3) sont préférables à des balayages uniques plus lents du même temps de séjour total des pixels. La zone d’imagerie prolongée photoblanchit souvent, mais d’autres sections d’explants restent viables. Plusieurs régions d’un support plat peuvent être imagées, chacune pendant 2 à 4 h, avec une durée d’incubation totale de 6 heures. Les séances d’imagerie au-delà de 6 h n’ont pas été systématiquement testées. La dégradation des neurites et les bulles sont des signes que la viabilité de l’explant diminue.

Résultats

Figure 1 : Configuration de la chambre d’incubation d’imagerie de cellules vivantes. (A) Appareil d’incubation d’imagerie en direct montrant des composants de chauffage, de solution et d’imagerie. Le double réchauffeur comprend une plate-form...

Matériaux