Imagerie et quantification de la régénération axonale dans les neurones ganglionnaires rétiniens de rat axotomisés

Résumé

Source : Portela-Lomba, M., et. al. Coculture de neurones ganglionnaires rétiniens de rat axotomisés avec des glia olfactifs engainants, en tant que modèle in vitro de régénération axonale adulte. J. vis. exp. (2020).

Cette vidéo démontre l’imagerie et la quantification de la régénération axonale dans des neurones ganglionnaires rétiniens (RGN) de rat axotomisés co-cultivés avec des cellules gliales olfactives humaines immortalisées. Les RGN sont immunomarqués, avec des somas rouges et des axones verts. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope à épifluorescence, et le pourcentage de neurones avec un axone et un indice de régénération axonale a été quantifié à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Culture de cellules gliales olfactives humaines (ihOEG, Ts12 et Ts14)

REMARQUE : Cette procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une enceinte de biosécurité pour la culture tissulaire.

1. Préparez 50 ml de milieu de culture ME10 OEG.
2. Préparez 5 ml de Dulbecco’s Modified Eagle Medium ou de DMEM/F12-Fetal Bovin Serum (FBS), dans un tube conique de 15 ml.
3. Réchauffez les deux milieux à 37 °C dans un bain d’eau propre pendant 15 min.
4. Décongeler les flacons de cellules Ts12 et Ts14 à 37 °C dans un bain d’eau propre.
5. Remettre en suspension et ajouter des cellules au milieu de culture DMEM/F12-FBS préparé à l’étape 2.
6. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
7. Aspirez au surnageant.
8. Ajouter 500 μL de milieu ME10 et remettre la pastille en suspension.
9. Préparez une boîte de culture cellulaire p60 avec 3 mL de ME10 et ajoutez la suspension cellulaire goutte à goutte.
10. Déplacez-vous pour répartir uniformément les cellules sur la plaque.
11. Cultiver des cellules à 37 °C dans 5 % de CO₂.
    REMARQUE : Après avoir atteint la confluence, au moins un autre passage doit être effectué pour optimiser les cellules pour la coculture. Une confluence de 90 % est nécessaire avant de les ensemencer sur les lamelles pour la coculture. Un confluent p-60 a un nombre moyen de cellules de 7 x 10⁵ pour les lignées cellulaires Ts14 et de 2,5 x 10⁶ pour les lignées cellulaires Ts12. Les lignées cellulaires Ts12 et Ts14 doivent être passées tous les 2 à 3 jours.

2. Préparation de l’ihOEG (Ts12 et Ts14) pour le test

REMARQUE : Cette étape doit être effectuée 24 heures avant la dissection et la coculture des neurones ganglionnaires rétiniens (RGN).

1. Traiter les lamelles de 12 mm de Ø avec 10 μg/mL de poly-L-lysine (PLL) pour 1 h.
   REMARQUE : Les lamelles peuvent être laissées toute la nuit dans la solution PLL.
2. Lavez trois fois les lamelles avec 1 tampon de phosphate salin (PBS).
3. Détachez les cellules Ts12 et Ts14 ihOEG de la boîte de culture cellulaire p60.
   1. Ajouter 4 mL de milieu de culture DMEM/F12-FBS à un tube conique de 15 mL. Réchauffer à 37 °C dans un bain d’eau propre.
   2. Retirez le milieu des plaques et lavez les cellules une fois avec 1 ml d’acide 1 x PBS-éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   3. Ajoutez 1 ml de trypsine-EDTA dans les cellules OEG et incubez pendant 3 à 5 min à 37 °C, 5 % de CO₂.
   4. Prélever les cellules à l’aide d’une pipette p1000 et les transférer dans le milieu préparé à l’étape 3.1.
   5. Centrifugeuse pendant 5 min à 200 x g.
   6. Aspirez au surnageant.
   7. Ajouter 1 mL de milieu ME10 et remettre la pastille en suspension.
   8. Comptez le nombre de cellules dans un hémocytomètre.
4. Semez 80 000 cellules Ts14 ou 100 000 cellules Ts12/puits sur les lamelles dans des plaques à 24 puits dans 500 μL de milieu ME10.
5. Cellules de culture à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 24 h.

3. Dissection du tissu rétinien

REMARQUE : Des rats Wistar mâles âgés de 2 mois sont utilisés comme source de RGN. Deux rétines (un rat) pour 20 puits d’une boîte cellulaire de 24 puits. Autoclave du matériel chirurgical avant utilisation. Le kit de dissociation de la papaïne est acheté dans le commerce (Table des matériaux). Suivez les instructions du fournisseur pour la reconstitution. Reconstituer l’acide D, L-2-amino-5-phosphonovalérique (APV) dans un stock de 5 mM et préparer les aliquotes.

1. Le jour du test, préparez le media.
   1. Préparez une boîte de culture cellulaire p60 avec 5 mL de solution saline équilibrée froide Earle’s ou EBSS (flacon 1 du kit de dissociation de la papaïne).
   2. Préparez une boîte de culture cellulaire p60 avec le flacon reconstitué 2 (papaïne) du kit de dissociation de la papaïne et 50 μL d’APV. Ajoutez ensuite 250 μL de flacon 3 reconstitué (DNase plus 5 μL d’APV).
   3. Dans un tube stérile, mélanger 2,7 mL de la fiole 1 avec 300 μL de la fiole 4 (inhibiteur de l’albumine-ovomucoïde de la protéase). Ajouter 150 μL de flacon 3 (DNase) plus 30 μL d’APV.
   4. Préparez 20 mL de milieu Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifiez un rat par asphyxie avec du CO₂.
3. Retirez la tête par décapitation à l’aide d’une guillotine, placez-la dans une boîte de Pétri de 100 mm et vaporisez la tête avec de l’éthanol à 70 % avant de la placer dans une hotte à flux laminaire.
4. Coupez les moustaches du rat avec des ciseaux afin qu’elles n’interfèrent pas avec la manipulation oculaire.
5. Saisissez le nerf optique avec une pince pour retirer suffisamment le globe oculaire pour pouvoir faire une incision à travers l’œil avec un scalpel.
6. Retirez le cristallin et l’humeur vitrée et retirez la rétine (tissu orange), tandis que les couches restantes de l’œil restent à l’intérieur (y compris la couche épithéliale pigmentaire).
7. Placez la rétine dans la boîte de culture cellulaire p60 préparée à l’étape 3.1.1.
8. Transférez la rétine dans la boîte de culture cellulaire p60 préparée à l’étape 3.1.2 et coupez-la avec le scalpel en petits morceaux d’environ 1 < 1 mm.
9. Transférer dans un tube de plastique de 15 ml.
10. Incuber le tissu pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 °C sous 5 % de CO₂, en agitant toutes les 10 min.
11. Dissociez les amas cellulaires en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette Pasteur en verre.
12. Centrifuger la suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 min.
13. Jetez le surnageant et, pour inactiver la papaïne, mettez à nouveau la pastille cellulaire en suspension dans la solution préparée à l’étape 3.1.3. (1,5 mL pour 2 yeux).
14. Pipeter soigneusement cette suspension cellulaire dans 5 mL de flacon 4 reconstitué.
15. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
16. Pendant la centrifugation, retirez complètement le milieu ME-10 de la plaque de cellule OEG à 24 puits (préalablement préparée à l’étape 2) et remplacez-le par 500 μL de milieu NB-B27 par puits.
17. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu NB-B27.
18. Plaque de 100 μL de suspension de cellules rétiniennes, par puits de la plaque m24, sur des lamelles monocouches traitées PLL ou OEG.
19. Maintenir les cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 96 h dans le milieu NB-B27.

4. Immunomarquage

1. Après 96 h, fixer les cellules pendant 10 min en ajoutant le même volume de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans 1x PBS au milieu de culture (600 μL) (concentration finale de PFA 2 %).
2. Retirez le média et le PFA de la plaque à 24 puits multiples et ajoutez à nouveau 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dans 1x PBS. Incuber pendant 10 min.
3. Jetez le fixateur et lavez 3 fois avec 1x PBS pendant 5 min.
4. Bloc avec 0,1 % de Triton X-100/1 % FBS dans PBS (PBS-TS) pendant 30 à 40 min.
5. Préparez les anticorps primaires dans le tampon PBS-TS comme suit : anticorps monoclonal SMI31 (contre les protéines MAP1B et NF-H) (1:500). 514 (reconnaît les protéines MAP2A et B) antisérum polyclonal de lapin (1:400).
6. Ajouter les anticorps primaires aux cocultures et incuber toute la nuit à 4 °C.
7. Le lendemain, jetez les anticorps et lavez les lamelles avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min.
8. Préparez les anticorps secondaires dans le tampon PBS-TS comme suit : Pour SMI-31, anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500). Pour 514, anti-lapin Alexa-594 (1:500).
9. Incuber des cellules avec les anticorps secondaires fluorescents correspondants pendant 1 h, à température ambiante ou RT dans l’obscurité.
10. Lavez les lamelles avec 1x PBS, 3 fois, pendant 5 min, dans l’obscurité.
11. Enfin, fixez les lamelles avec un support de montage (Table des matériaux) et maintenez-les à 4 °C.
    REMARQUE : Chaque fois que nécessaire, une coloration fluorescente des noyaux avec du DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole) peut être effectuée. Avant le montage, incuber les cellules pendant 10 min dans l’obscurité avec du DAPI (10 μg/mL dans 1x PBS). Lavez les lamelles 3 fois avec 1x PBS, et enfin, montez les lamelles avec le support de montage.

5. Quantification de la régénération axonale

REMARQUE : Les échantillons sont quantifiés sous l’objectif 40x d’un microscope à épifluorescence. Un minimum de 30 photos doit être pris sur des champs aléatoires, avec au moins 200 neurones, à quantifier pour chaque traitement. Chaque expérience doit être répétée au moins trois fois.

1. Quantifier le pourcentage de neurones avec un axone (neurite SMI31 positif) par rapport à la population totale de RGN (identifiés avec une immunocoloration positive MAP2A/B 514 du corps neuronal et des dendrites).
2. Quantifier l’indice de régénération axonale ou la longueur axonale moyenne (μm/neurone). Ce paramètre est défini comme la somme des longueurs (en μm) de tous les axones identifiés, divisée par le nombre total de neurones comptés, qu’ils présentent un axone ou non. La longueur axonale est déterminée à l’aide du plugin NeuronJ du logiciel d’imagerie ImageJ (NIH-USA).
3. Calculez la moyenne, l’écart-type et la signification statistique à l’aide du logiciel approprié.

Matériaux