Imagerie cellulaire à l’aide de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale

Abstract

Source : Daniele, F., et. al Sondes TIRFM et GFP sensibles au pH pour évaluer la dynamique des vésicules de neurotransmetteurs dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y : imagerie cellulaire et analyse des données. J. vis. exp. (2015).

Cette vidéo montre l’imagerie de cellules de neuroblastome humain à l’aide d’un microscope à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les vésicules synaptiques marquées au fluorophore. Les cellules sont d’abord focalisées en mode épifluorescence. Des ajustements sont ensuite effectués pour obtenir une réflexion interne totale, générant des ondes évanescentes qui excitent sélectivement les fluorophores près de la membrane. Avant l’imagerie TIRF, les paramètres d’acquisition sont configurés et la fréquence d’échantillonnage est définie.

Protocol

1. Culture cellulaire et transfection

1. SH-SY5Y culture cellulaire
   REMARQUE : Les expériences ont été réalisées à l’aide du neuroblastome humain SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). Les cellules SH-SY5Y se développent sous la forme d’un mélange d’amas flottants et de cellules adhérentes. Suivez les instructions rapportées dans le protocole (densité cellulaire, rapport de division, etc.) pour que les cellules qui se développent soient fermement attachées au couvercle en verre, ce qui est crucial pour la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRFM).
   1. Avant de commencer, sous l’enceinte de biosécurité à flux laminaire, préparez le volume opportun de solution saline tampon de phosphate stérile (PBS) et de milieu de culture.
      1. Préparer 50 ml de PBS avec des concentrations de 150 mM de chlorure de sodium (NaCl), 24 mM de tampon phosphate, pH 7,4. Filtrez la solution.
      2. Préparez 50 ml de milieu cellulaire à partir du milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec un taux élevé de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, de la pénicilline (100 U/ml), de la streptomycine (100 μg/ml), de la L-glutamine (2 mM) et du pyruvate de sodium (1 mM). Filtrez la solution.
   2. Retirez tout le milieu de croissance et lavez les cellules avec 3 ml de PBS.
   3. Incuber des cellules avec 2 ml d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,05 % (pour une boîte de Pétri de 6 cm) pendant 5 min à 37 °C, 5 % de CO_2, et détacher les cellules à l’aide d’une pipette.
   4. Inactiver la trypsine en ajoutant 2 ml de DMEM et recueillir les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 5 min.
   5. Retirer le surnageant, ajouter 1 ml de DMEM à la pastille et pipeter la solution de haut en bas suffisamment pour disperser les cellules dans une suspension unicellulaire.
   6. Séparez-les 1:4 dans une boîte de Pétri neuve de 6 cm de diamètre contenant 3 ml de milieu complet. Maintenir les cellules en culture dans des boîtes de Pétri de 6 cm de diamètre à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂. Sous-culture une fois par semaine, ou lorsqu’elles ont couvert 80 à 90 % de la surface.
2. Placage cellulaire SH-SY5Y pour l’imagerie
   1. Pour les expériences TIRFM, les cellules sur plaque sont placées sur des couvercles en verre. Utilisez des couvercles en verre d’une épaisseur de 0,17 ± 0,005 mm et d’un indice de réfraction de 1,5255 ± 0,00015. Avant de commencer, préparez les lamelles en verre comme suit :
      1. Nettoyez les lamelles en verre avec de l’éthanol à 90 % pendant la nuit.
      2. Rincez-les abondamment à l’eau distillée (trois changements d’eau distillée). Couvercles en verre sec dans un four de séchage.
      3. Placez les couvercles dans des boîtes de Pétri en verre et stérilisez-les dans un four préchauffé à 200 °C pendant 3 h.
   2. La veille de la transfection, placez chaque lamelle dans une boîte de Pétri de 3,5 cm, ajoutez 1 ml de milieu de culture et incubez à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
   3. Trypsiniser les cellules comme décrit aux étapes 1.1.3 à 1.1.5, suspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de milieu complet et compter. Calculez le volume correct de suspension cellulaire à ajouter à chaque boîte de Pétri pour obtenir 3 x 10⁵ cellules/puits. Cette densité est nécessaire pour une croissance cellulaire optimale et une transfection efficace. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ O/N.
3. SH-SY5Ytransfection par polyéthylénimine (PEI)
   REMARQUE : Pour visualiser la dynamique des vésicules synaptiques, un vecteur pCB6 contenant synapto-pHluorin a été utilisé. La synapto-pHluorin a été générée par la fusion dans le cadre d’une variante sensible au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) et de la protéine de membrane vésiculaire synaptobrevin 2. Cette construction a été largement utilisée pour étudier les propriétés des vésicules synaptiques dans les neurones.
   1. Avant de commencer la transfection, préparez 10 ml des solutions suivantes. Conservez les solutions pendant 1 mois maximum.
      1. Préparez une solution de NaCl de 150 mM. Ajuster à un pH de 5,5 avec de l’acide chlorhydrique (HCl) 0,01 N.
      2. Préparer une solution de PEI à 10 % de polyéthylénimine (PEI ; 25 kDa linéaire) dans une solution de NaCl de 150 mM. Le pH de la solution monte à 8,8. Ajuster le pH à 7,8 avec 0,01 N HCl.
   2. 24 heures après le placage, retirer le milieu et rafraîchir avec 1,5 ml de milieu complet. Conservez les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂.
   3. Sous l’enceinte de biosécurité à flux laminaire, dans un tube microfuge de 1,5 ml, ajouter 3 μg d’ADN plasmidique à 25 μl de solution de NaCl de 150 mM et à 100 μl de solution de PEI par boîte de Pétri de 3,5 cm.
   4. Agitez au vortex pendant 10 secondes, puis incubez le mélange ADN/PEI pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
   5. Ajoutez délicatement le mélange ADN/PEI dans la boîte de Pétri contenant des lamelles avec des cellules et secouez doucement pour répartir uniformément le réactif dans la boîte de Pétri.
   6. Après 4 h, changez de milieu et incubez les cellules O/N à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂. Effectuer des expériences d’imagerie 24 à 48 h après la transfection.

2. Imagerie cellulaire par TIRFM

1. Configuration de l’imagerie
   1. Effectuez l’imagerie TIRF avec la configuration décrite dans Figure 1. Il comprend un microscope inversé motorisé (Figure 1, encadré A), la source laser (Figure 1, encadré B), et le curseur TIRF (Figure 1, encadré C). Atteignez l’éclairage TIRFM grâce à une grande ouverture numérique (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X huile objectif à immersion.
   2. Pour l’éclairage TIRFM, utilisez un laser argon-ion multilignes (458/488/514 nm) de 100 mW. À l’aide d’une fibre monomode, introduisez la lumière laser polarisée linéairement dans le trajet du faisceau via le curseur TIRF. Insérez le curseur TIRF dans le plan du diaphragme du champ lumineux du trajet du faisceau de lumière réfléchie.
      1. Pour un éclairage à grand champ, connectez le microscope à une lampe à arc court au mercure conventionnelle HBO à lumière blanche. Un double prisme de maintien de polarisation dans le curseur assure la combinaison simultanée de l’éclairage TIRF et de la lumière blanche.
   3. Filtrez la lumière laser à l’aide d’un filtre d’excitation (bande passante 488/10 nm) monté sur une roue à filtres et introduit dans la trajectoire du laser. Utilisez un obturateur à grande vitesse, contrôlé par logiciel, pour permettre un contrôle rapide de l’éclairage laser. Pour l’analyse de la pHluorine, montez un filtre d’émission passe-bande 525/50 nm. Capturez des images numériques (512 x 512 pixels) sur une caméra CCD rapide refroidie avec le logiciel Image ProPlus.
2. Réalisation de l’éclairage TIRF (Figure 2)
   1. Allumez les lasers, l’ordinateur, la caméra, la roue à filtres et les contrôleurs de l’obturateur ; Ensuite, attendez 20 minutes avant de commencer l’expérience car les lasers ont besoin de se réchauffer et de se stabiliser.
   2. Avant l’imagerie, faites le volume opportun des solutions suivantes.
      1. Préparer 50 ml de solution de Krebs (KRH) à 125 mM de NaCl, 5 mM de chlorure de potassium (KCl), 1,2 mM de sulfate de magnésium (MgSO₄), 1,2 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄), 25 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) (tamponné à pH 7,4), 2 mM de chlorure de calcium (CaCl₂), et 6 mM de glucose.
      2. Préparez 10 ml de solution de KCl-KRH (pH 7,4) à 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO₄, 1,2 mM de KH₂PO₄, 25 mM de HEPES (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl₂ et 6 mM de glucose.
   3. Retirez le couvercle en verre avec les cellules transfectées et insérez-le dans la chambre d’imagerie appropriée. Assemblez la chambre et ajoutez 500 μl de solution KRH au centre du verre.
   4. Ajoutez de l’huile sur l’objectif. Placez la chambre d’imagerie sur la platine du microscope et placez l’objectif sous la lamelle en verre. Placez le couvercle du coffre-fort sur l’échantillon.
   5. En mode épifluorescence, concentrez-vous sur la lamelle (surface supérieure) et choisissez les cellules transfectées placées au centre de la chambre. Sélectionnez des cellules dont le signal fluorescent peut être clairement enregistré en utilisant un temps d’exposition inférieur à 80 ms.
   6. Sous contrôle logiciel, passez à l’éclairage TIRF en mode direct.
   7. Pour régler la configuration TIRF, vérifiez la position du faisceau qui émerge de l’objectif sur le couvercle de l’échantillon (Figure 2B). Lorsque le faisceau est positionné au centre de la lentille de l’objectif (Figure 2A, à gauche), un point est visible au centre de la couverture de l’échantillon TIRF (Figure 2B, à gauche), et la cellule est imagée en mode épifluorescence (plusieurs plans de mise au point, fluorescence de fond élevée ; Figure 2C, à gauche).
   8. Pour atteindre l’angle critique, déplacez le point focalisé dans la direction Y (vers l’avant ou vers l’arrière ; Figure 2B, centre) à l’aide de la vis de réglage de l’angle sur le curseur TIRF (Figure 1C). Lorsque le faisceau converge sur le plan de l’échantillon à un angle supérieur à l’angle critique (Figure 2A, à droite), la tache disparaît et une ligne droite, fine et focalisée est évidente au milieu du couvercle de l’échantillon (Figure 2B, à droite).
   9. Pour affiner l’angle TIRF, utilisez l’échantillon de cellule (Figure 2C). Regardez l’image de fluorescence dans la vidéo. À ce stade, une image semblable à l’épifluorescence est encore visible. Déplacez doucement la vis jusqu’à ce que la condition TIRF soit atteinte : un seul plan optique de la cellule est mis au point (c’est-à-dire la membrane plasmique en contact avec la lamelle). Il en résulte une image plate avec un contraste élevé (Figure 2C, à droite).
3. Exemple d’imagerie
   1. Définissez l’expérience time-lapse monocanal. Pour minimiser le photoblanchiment, capturez l’image en utilisant un temps d’exposition faible et un gain élevé. Les temps d’exposition appropriés sont compris entre 40 et 80 ms. Acquérez des images à une fréquence d’échantillonnage de 1 à 2 Hz. La cinétique des vésicules peut être mieux appréciée en échantillonnant à des fréquences plus élevées (10 Hz). Le temps d’observation habituel est généralement de 2 min.

Results

Graphique 1. Installation du microscope TIRF. Vue schématique et image (en médaillon) du système de microscope TIRF. L’installation comprend le microscope inversé motorisé Axio Observer Z1 (A), un laser Argon-ion multiligne de 100 mW (B) et...

Materials