Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires

Résumé

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo fait la démonstration de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les événements exocytaires dans les neurones corticaux. Un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP) sensible au pH devient fluorescent lors de la fusion des vésicules, avec une excitation sélective TIRF capturant l’exocytose membranaire-proximale en imagerie time-lapse.

Protocole

1. Imagerie des événements exocytaires par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Remarque : Ce protocole nécessite un équipement de microscopie spécialisé, y compris une chambre environnementale pour maintenir la température, l’humidité et le dioxyde de carbone (CO₂), un microscope à fluorescence par réflexion interne totale inversée (TIRF) équipé d’un éclairage épifluorescent, un objectif TIRF à fort grossissement et à grande ouverture numérique (NA), un XYZ automatisé et un détecteur sensible de dispositif à couplage de charge (CCD). Ce protocole utilise un microscope inversé entièrement automatisé équipé d’un objectif TIRF 100x 1,49 NA, d’un laser à semi-conducteurs de 491 nm et d’un CCD MULTIPLICATEUR D’ÉLECTRONS (EM-CCD). Tous les équipements sont contrôlés par un logiciel d’imagerie et de contrôle laser. Avant le début du protocole d’imagerie, mettez sous tension la chambre environnementale, la scène, la lampe, l’ordinateur et la caméra.

1. Sélectionnez l’objectif dans le logiciel d’imagerie. Une fois l’objectif en place, fixez le chauffage de l’objectif autour du collier.
2. Vérifiez que l’objectif est entièrement abaissé avant de fixer l’incubateur de scène dans l’emplacement de scène. Versez de l’eau distillée uniformément dans les entrées de l’incubateur de la scène pour éviter les déversements.
3. Allumez le système d’incubation. Ouvrez la vanne du réservoir de CO₂ et confirmez que la pression est appropriée pour le système conformément aux instructions du fabricant. Laissez la chambre atteindre 5 % de CO₂ et 37 °C. Avant d’ajouter la boîte d’imagerie, placez une coupelle vide dans l’incubateur pour éviter la condensation de l’eau sur l’objectif.
4. Mettez la source laser sous tension.
5. Ouvrez l’incubateur de scène et ajoutez de l’huile d’immersion dans l’objectif. Placez l’échantillon dans l’incubateur et stabilisez-le à l’aide de bras de stabilité ou d’un poids à plat. Levez l’objectif jusqu’à ce que l’huile entre en contact avec le fond de l’échantillon. Passez à l’éclairage en lumière transmise et trouvez le plan focal neuronal à travers les oculaires.
6. Démarrez le logiciel laser et connectez-le au logiciel de contrôle laser. Réglez l’éclairage sur champ large et sélectionnez l’objectif (100x 1,49 NA TIRF est recommandé). Réglez l’indice de réfraction de l’échantillon (cellules ~1,38). Ajustez l’intensité du laser en décochant « TTL » (Transistor-Transistor Logic) pour le laser 491 nm. Réglez le curseur sur 100, puis ramènez-le à une valeur comprise entre 20 % et 40 %. Recochez « TTL ».
7. Concentrez-vous à nouveau sur l’échantillon en éclairage en lumière transmise. Accédez au logiciel d’imagerie, sélectionnez l’éclairage laser 491 nm et ouvrez l’obturateur. Ajustez avec précision le point focal du laser au plafond et centrez-le au centre du diaphragme à champ fermé avec le condenseur retiré. Placez le condenseur à l’envers sur le banc optique afin de ne pas rayer l’objectif.
8. Remplacez le condenseur, accédez au logiciel TIRF et réglez la profondeur de pénétration () sur 110 nm. Ensuite, passez de l’éclairage grand champ au mode d’éclairage TIRF pour l’imagerie.
9. Trouvez les cellules exprimant la protéine membranaire associée aux vésicules 2 (VAMP2) à travers les oculaires en utilisant l’épifluorescence à grand champ avec la source de lumière épifluorescente.
   1. Ajustez les paramètres d’imagerie (temps d’exposition, gain et puissance laser) pour maximiser le rapport signal/bruit et la plage dynamique en utilisant le temps d’exposition minimal et l’intensité laser pour réduire le photoblanchiment et la phototoxicité (par exemple, exposition entre 50 - 100 ms, avec un gain de 15 à 30 % de puissance laser maximale).
   2. Réglez l’autofocus continu par cellule. Acquérez un ensemble d’images en accéléré avec une acquisition toutes les 0,5 s pendant 5 min. Pour la condition stimulée par la nétrine-1, ajoutez 500 ng/ml de nétrine-1 dans la boîte de cellules dans une hotte à flux laminaire et remettez la boîte dans l’incubateur pendant 1 heure avant l’imagerie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35mm boîtes d’imagerie à cellules vivantes à fond de verre	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Doit être enduite de 1mg/mL de poly-D-lysine et rincée avant le placage des cellules
Olympus IX81-ZDC2 microscope inversé	Olympus
Lampe au xénon Lambda LS	Sutter Instruments Company
Incubateur supérieur de scène environnementale	Tokai Hit
100x 1.49 NA Objectif TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell Logiciel de contrôle TIRF Olympus			Logiciel utilisé pour contrôler lasers pour l’imagerie TIRF
Fidji (Image J)	NIH	ImageJ version 1.49t
Rabbit polyclonal anti-human VAMP2	Signalisation cellulaire	11829
Poly-D-lysine	Sigma	p-7886	Dissous dans de l’eau stérile à 1mg/mL