Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo fait la démonstration de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les événements exocytaires dans les neurones corticaux. Un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP) sensible au pH devient fluorescent lors de la fusion des vésicules, avec une excitation sélective TIRF capturant l’exocytose membranaire-proximale en imagerie time-lapse.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Imagerie des événements exocytaires par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Remarque : Ce protocole nécessite un équipement de microscopie spécialisé, y compris une chambre environnementale pour maintenir la température, l’humidité et le dioxyde de carbone (CO₂), un microscope à fluorescence par réflexion interne totale inversée (TIRF) équipé d’un éclairage épifluorescent, un objectif TIRF à fort grossissement et à grande ouverture numérique (NA), un XYZ automatisé et un détecteur sensible de dispositif à couplage de charge (CCD). Ce protocole utilise un microscope inversé entièrement automatisé équipé d’un o....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm boîtes d’imagerie à cellules vivantes à fond de verre	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Doit être enduite de 1mg/mL de poly-D-lysine et rincée avant le placage des cellules
Olympus IX81-ZDC2 microscope inversé	Olympus
Lampe au xénon Lambda LS	Sutter Instruments Company
Incubateur supérieur de scène environnementale	Tokai Hit
100x 1.49 NA Objectif TIRF	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell Logiciel de contrôle TIRF Olympus			Logiciel utilisé pour contrôler lasers pour l’imagerie TIRF
Fidji (Image J)	NIH	ImageJ version 1.49t
Rabbit polyclonal anti-human VAMP2	Signalisation cellulaire	11829
Poly-D-lysine	Sigma	p-7886	Dissous dans de l’eau stérile à 1mg/mL

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