Inhibition de l’activité neuronale et sa détection par électrophysiologie chez le rat

Résumé

Source : Lai, J., et al. Enregistrement électrophysiologique simultané et micro-injections d’agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre une technique basée sur la micro-injection pour l’enregistrement neuronal simultané et l’inhibition dans le colliculus supérieur du rat. La procédure implique un ciblage stéréotaxique, un forage du crâne et l’insertion d’un injectrode, qui délivre un neurotransmetteur inhibiteur tout en enregistrant l’activité neuronale. La stimulation lumineuse évoque des potentiels d’action, tandis que la micro-injection de médicaments supprime l’excitabilité neuronale. À mesure que les niveaux de neurotransmetteurs diminuent, l’activité neuronale revient à la ligne de base, ce qui permet d’étudier à la fois l’inhibition et la récupération.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Montage de la pipette d’enregistrement-injection

1. Tirez un capillaire en verre d’environ 7 cm de long (1 mm de diamètre extérieur) à l’aide d’un extracteur de pipette.
2. Cassez l’extrémité du capillaire et vérifiez l’ouverture au microscope optique. Vérifiez que le diamètre intérieur est compris entre 30 μm et 40 μm.
3. Insérez un fil d’argent de 7 cm de long dans le capillaire en verre, avec environ 1 cm dépassant de l’extrémité non effilée de la pipette en verre.
4. Pliez l’excédent de filament orthogonalement au capillaire de verre.
5. Appliquez une gouttelette de colle plastique souple sur la tige d’une aiguille hypodermique de 30 G.
6. Insérez une aiguille hypodermique de 30 G dans la pipette en verre selon les schémas présentés à la figure 1.
7. Ajoutez une deuxième couche de colle pour assurer une bonne étanchéité de la jonction entre la pipette en verre et l’aiguille hypodermique.
8. Laissez la pipette sécher avec la pointe vers le haut pendant environ 12 heures pour assurer un bon durcissement de la colle. Le résultat final est illustré à la figure 2.

REMARQUE : Cette procédure est effectuée lors d’expériences aiguës et la stérilisation de la pointe de la pipette n’est pas requise.

2. Préparation de

1. l’animal : Placez le rat dans une boîte d’anesthésie.
2. Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane à 4 % pendant 5 à 10 min.
3. Placez l’animal sur une table stéréotaxique avec un coussin chauffant et une sonde rectale pour maintenir une température corporelle de 37 °C. Utilisez un cône nasal pour maintenir l’anesthésie avec 2 % d’isoflurane. Fixez la tête du rat à l’aide de barres d’oreille et d’un porte-dents.
4. Appliquez une pommade ophtalmique ou des gouttes ophtalmiques, qui comprennent des gouttes d’atropine à 1 % pour aider à la dilatation de la pupille. Pour éviter le dessèchement, appliquez des gouttes lubrifiantes environ toutes les 30 minutes.
5. Rasez la tête et nettoyez-la avec 10 % de povidone iodée.
6. Pour une anesthésie locale, injectez 0,5 ml de lidocaïne à 2 % sous le cuir chevelu à 2-3 endroits en soulevant la peau et en insérant la pointe de l’aiguille.
7. Confirmez un niveau d’anesthésie adéquat en effectuant un pincement des orteils et en observant l’absence de mouvement. De plus, surveillez la fréquence cardiaque pour vous assurer qu’elle est dans les valeurs normales (300 à 400 battements/min).
8. Incisez le cuir chevelu en ligne droite le long de la médiane avec une lame de scalpel #10 pour exposer les sutures coronaires et sagittales.
9. Mettez en évidence les points Lambda et Bregma en écartant le tissu qui recouvre le crâne à l’aide d’une spatule chirurgicale.
10. Nivelez le crâne de manière à ce que les positions Bregma et Lambda soient sur le même plan.
11. Pour régler le point de référence, utilisez un appareil stéréotaxique avec un tube de verre monté pour le placer juste au-dessus de Bregma. Il s’agira du « zéro » pour les coordonnées de mesures antéro-postérieures et médio-latérales.
12. Définissez le point d’intérêt en déplaçant le support stéréotaxique aux coordonnées requises, notez les coordonnées stéréotaxiques et tracez un carré autour de la zone cible qui marque l’endroit où la craniotomie sera effectuée.
13. Utilisez une perceuse chirurgicale avec un foret stérilisé le long du carré marqué, lentement sans pression pour retirer lentement le matériau osseux. Attention à ne pas forer trop longtemps au même endroit, car cela produira de la chaleur et provoquera des lésions sur le cortex.
14. Lorsque l’os délimitant la craniotomie devient suffisamment mince, retirez soigneusement la section crânienne à l’aide d’une pince à épiler pour exposer le cortex.
15. Irriguez fréquemment le cortex exposé avec du liquide céphalo-rachidien artificiel pour prévenir la dessiccation des tissus.
    REMARQUE : L’élimination de la dure-mère n’est pas nécessaire chez le rat, car l’extrémité de l’injecteur est suffisamment solide pour pénétrer.

3. Remplissage et montage du système d’injection

1. Remplissez la microseringue de 5 à 10 μl par aspiration avec de l’huile minérale.
2. Remplissez l’aiguille hypodermique avec la pipette en verre fixe avec une solution de Chicago Sky Blue (CSB) à 0,5 % et d’acide γ-aminobutyrique (GABA) à 300 μM ou une solution de lidocaïne à 2 % avec 0,5 % de CSB. Diluer toutes les solutions avec une solution saline.
   1. Dans le cas d’une substance abondante, remplissez à l’aide d’une seringue ordinaire et utilisez les techniques de précaution habituelles pour éviter la formation de bulles d’air.
   2. Dans le cas de substances plus coûteuses, utilisez de l’huile minérale pour remplir l’injecteur et l’agent chimique peut ensuite être introduit par aspiration. Comme la différence de densité entre l’huile minérale et l’eau est relativement élevée, cette substance est un bon candidat pour l’injection de solutions aqueuses.
      REMARQUE : Un colorant peut être ajouté pour confirmer la séparation entre deux liquides.
3. Pour remplir la pipette d’injection, remplissez une seringue de 1 ml avec la solution par aspiration, puis injectez lentement la solution dans la pipette d’injection.
4. Portez une attention particulière aux fuites dans les régions indiquées à la figure 1 en écouvillonnant ces zones et en observant les fuites en injectant lentement la solution avec la seringue.
5. Retirez la seringue de 1 ml. Ce faisant, assurez-vous de maintenir une légère pression sur le piston afin que le vide n’élimine pas la solution de la pipette d’injection.
6. Remplissez la microseringue d’huile minérale par aspiration et fixez-la fermement à la pipette d’injection remplie, puis essuyez soigneusement tout excès de solution de l’injecteur assemblé avec de la gaze.
7. Vérifiez que l’embout n’est pas bloqué en injectant un très petit volume, suffisamment pour voir une petite goutte se former à l’extrémité de la pipette en verre.
8. Montez l’injecteur sur le système de micropompe et assurez-vous qu’il est bien fixé.
9. Positionnez soigneusement l’embout injectrode aux coordonnées de la cible et abaissez l’embout à la surface du cortex.
10. Abaissez lentement l’injectrode à l’aide de l’appareil stéréotaxique sur la structure cible (colliculus supérieur dans ce cas) en utilisant les coordonnées anatomiques appropriées.
11. Couvrez le cortex exposé avec de la gélose chaude pour éviter la dessiccation des tissus.

4. Injection et inactivation réversible

1. Réglez la pompe de micro-injection pour injecter 400 à 800 nl à 40 nl/min et appuyez sur Run pour démarrer l’injection. Notez que le taux de pic montrera une réduction pendant l’injection.
   REMARQUE : Dans la configuration expérimentale, l’activité neuronale s’est rétablie dans l’heure qui suit la fin de l’administration de GABA. Tout dispositif mécanique calibré peut être utilisé pour appliquer une pression sur la seringue de micro-injection afin de réaliser l’injection.
2. Après l’acquisition des données électrophysiologiques, euthanasier en utilisant une méthode approuvée par le comité local d’éthique animale.

Résultats

Figure 1 : Représentation schématique de l’assemblage d’injectrode. Une micro-seringue (A) est fixée à la pipette d’enregistrement-injection, qui se compose d’une aiguille hypodermique de 30 G (B) co...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pompe d’injection (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Console d’injection (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Seringue Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Seringues entre 5 et 10 μL utilisées
Colle cyanoacrylate	gel Krazy Glue	KG86648R	La forme gel est plus facile à appliquer sur la tige de l’aiguille hypodermique 30G
Pipettes en verre	WPI	#TW100F-4	Paroi mince, 1 mm de diamètre extérieur, 0,75 mm de diamètre intérieur avec pipettes à filament utilisées
Extracteur de pipette à aiguille 720	Kopf	720
Fil d’argent	A-M Systems, Inc.	782500	Nu 0,010 po