Implantation d’une fenêtre de moelle épinière chez une souris pour l’imagerie in vivo

Résumé

Source : Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomie et implantation de la fenêtre de la moelle épinière chez la souris. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre l’implantation d’une fenêtre de la moelle épinière chez une souris anesthésiée pour l’imagerie in vivo. Le protocole stabilise la moelle épinière exposée à l’aide d’un verre de couverture en borosilicate et d’une plaque arrière imprimée en 3D. Cette méthode permet la microscopie à deux photons à haute résolution pour étudier la dynamique de la barrière hémato-encéphalique et les interactions neurovasculaires.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation du verre de protection

1. Appliquez délicatement un verre de protection en borosilicate de 3 mm sur le cordon exposé.
2. Assurez-vous que l’agarose est refroidie à 39 °C. À l’aide d’une petite spatule, appliquez de l’agarose/aCSF (liquide céphalo-rachidien artificiel) chaud à 2 % sur le bord du verre de protection et laissez l’action capillaire l’aspirer sous la surface.
   Remarque : À des températures inférieures à 39 °C, l’agarose peut commencer à se gélifier. Si cela se produit, réchauffez-le à l’aide d’un bain-marie ou d’un micro-ondes. Certains opérateurs préfèrent appliquer d’abord une goutte d’agarose et poser le verre de protection sur le dessus.
3. Appliquez un adhésif tissulaire sur les apophyses articulaires osseuses exposées des vertèbres adjacentes intactes au niveau thoracique 11 et au niveau thoracique 13. Appliquez un adhésif tissulaire supplémentaire dans un anneau autour du site de laminectomie, sur le tendon adjacent et l’apophyse transversale.
   Remarque : Un adhésif tissulaire est nécessaire pour une bonne adhérence au ciment dentaire dans les étapes suivantes. Les apophyses articulaires forment un siège naturel sur lequel la plaque dorsale peut reposer de manière stable (Figure 1). L’adhésion aux processus articulaires formera les points d’attachement les plus forts.
4. Mélangez du ciment dentaire avec de l’accélérateur dans un plateau de mélange en porcelaine. À l’aide d’une petite spatule, transférez le ciment dentaire sur la couche adhésive tissulaire. Utilisez du ciment dentaire pour faire adhérer la plaque arrière au champ chirurgical centré sur la fenêtre. Attendez 10 minutes pour que le ciment dentaire durcisse.
   Remarque : L’adhérence ferme de la plaque arrière aux processus articulaires antérieurs et postérieurs assure la stabilité structurelle fondamentale de l’implant.
5. Utilisez du ciment dentaire supplémentaire pour remplir la base intérieure de la plaque arrière et le dessous de la plaque arrière : interface tissulaire.
   Remarque : L’application supplémentaire de ciment dentaire améliore l’adhérence et réduit le risque de fuite du fluide d’immersion de l’objectif du microscope (solution saline) par le bas de la plaque arrière.
6. Avancez le support de plaque arrière à fourche dans la position appropriée au-dessus de la fenêtre. Fixez la plaque arrière dans le support de plaque arrière à l’aide de vis.
   Remarque : Ce protocole utilisait un support de plaque arrière usiné sur mesure (Figure 2G\u2012H).
7. Appliquez une solution saline sur la plaque arrière pour tester les fuites. En cas de fuite de liquide, séchez la zone et appliquez plus de ciment dentaire.

2. Préparation de

1. l’imagerie Transférez l’animal sur la plate-forme chirurgicale jusqu’à la table optique.
   Remarque : Notre plate-forme chirurgicale, notre support de plaque dorsale et notre support de cône nasal d’isoflurane peuvent être transportés entre les stations d’imagerie chirurgicale et à deux photons comme une seule unité tout en appliquant une anesthésie continue à l’isoflurane (Figure 2D, H). Des unités similaires peuvent être assemblées à partir de fourches, de poutres et de poteaux de soutien que l’on peut se procurer auprès de sources commerciales (par exemple, ThorLabs). Pour la microscopie intravitale, il doit y avoir au moins 11 pouces d’espace entre l’objectif du microscope et la table optique pour s’adapter à la hauteur de la plate-forme chirurgicale.
2. Fixez la plate-forme chirurgicale à la table optique à l’aide d’un poteau de montage en acier inoxydable et d’une fourche de serrage contre-alésée.
3. Appliquez une solution saline fraîche dans le puits de la plaque arrière. Abaissez une lentille d’immersion dans l’eau dans le puits.
4. Utilisez une lumière transmise ou une lumière d’épifluorescence pour identifier la zone d’intérêt et la mise au point. Passez en mode balayage laser et effectuez une imagerie in vivo selon les filtres de longueur d’onde d’excitation laser à deux photons, dichroïques et passe-bande appropriés pour les fluorophores présents dans le tissu6.

Résultats

Figure 1. Représentation schématique de la position anatomique de la fenêtre de la moelle épinière. A) Représentation schématique de la vue supérieure d’un corps vertébral thoracique inférieur, d’un processus épine...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque arrière ovale imprimée en 3D	sur mesure		Champ d’imagerie stabilisant
Microscope de dissection chirurgical	Leica	M205 C	Équipé de Leica FusionOptics, d’un objectif Planapo 0.63x de la série M et d’une platine
de glissementCaméra microscope	Leica	MC170	Caméra couleur HD pour la visualisation du champ opératoire
Platine de glissement	Leica	10446301	La platine de glissement est constituée de deux plaques métalliques. La plaque de base est fixe. La plaque supérieure coulisse sur une interface graissée pour permettre un mouvement de rotation et linéaire.
Poste chirurgical et fourche de stabilisation	Whale Manufactoring		Custom Laminectomie
SomnoSuite Unité d’administration d’isoflurane à faible débit	Kent Scientific	SS-01	Administration d’anesthésie chirurgicale avec vaporisateur numérique intégré
Poteau de montage en acier inoxydable de 1,5 pouce	ThorLabs	P50/M	Pour le montage du poste chirurgical sur une table optique pour l’imagerie
à deux photonsFourche de serrage contre-alésée pour montage 1,5" Poteau	ThorLabs	PF175	Pour stabiliser le poste chirurgical Monter sur une table optique pour l’imagerie à deux photons
Microdrill osseux idéal	Appareil de Harvard	72-6065	Amincissement de l’os pour laminectomie
Bain d’eau	Fisher Scientific	15-462-10	Sérum salin chauffant
Pistolet de cautérage	FST	18010-00	Cautérisation des saignements mineurs
Coussin chauffant	Benchmark	BF11222	1,9 » x 4,5 » Chauffage en silicone avec câbles en téflon de 20 », 10W, 5V
Sonde rectale thermocouplée de type K	Physitemp	RET3	Mesure de la température corporelle de la souris
Vaseline	Sigma	8009-03-08	Sonde rectale lubrifiante
Contrôleur thermique régulé par rétroaction	personnalisé	NA	Les alternatives disponibles dans le commerce comprennent la série Physitemp TCAT
PVA Lances oculaires chirurgicales	Beaver-visitec international	40400-8	Absorbeur de sang
Tondeuse électrique	Wahl	41590-0438	Lame de coupe de fourrure de souris
, #11	FST	14002-14	Pince à outil chirurgical
, #5	FST	11254-20	Pince à outil chirurgical
, #4	FST	14002-14	Outil chirurgical
Pince dentée en titatnium	WPI	555047FT	Outil chirurgical
Ciseaux à iris en titane	WPI	555562S	Outil chirurgical
Adhésif pour tissus Vetbond	3M	084-1469SB	Préparation de la surface du tissu pour acrylique dentaire
Plateau de mélange en céramique	Jack Richeson	420716	Mélange d’agent acrylique dentaire avec accélérateur
Orthojet dentaire acrylique	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Collage permanent de la plaque arrière sur le tissu
Petit verre de couverture rond, épaisseur #1, 3 mm	Appareil Harvard	64-0720	fenêtre optique
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Pour aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Pour aCSF
Glucose	Fisher Scientific	50-99-7	Pour aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Pour aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Pour aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	Pour aCSF
Carprofène	Rimadyl	QM01AE91	Analgésie
Eau bactériostatique	Henry Schein	2587428	Diluant pour carprofène
Isoflurane	Henry Schein	11695-6776-2	Anesthésie
Solution de sonnerie lactée	Baxter	0338-0117-04	Hydratation pour souris
Agarose High EEO	Sigma	A9793	point de gel 34-37 degrés C
Pommade lubrifiante ophtalmique	Akwa Tears	68788-0697	Prévenir le dessèchement de la cornée
MOM Microscope à deux photons	Sutter