Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Injection de facteurs de reprogrammation dans la
configuration du cerveau
- animal, placement stéréotaxique et forageREMARQUE : Ce protocole se concentre sur l’utilisation d’Ascl1, Lmx1a et Nurr1 (ALN) pour la reprogrammation de la glie NG2 (Neuron-Glial Antigen 2) en interneurones. D’après notre expérience, des interneurones d’un phénotype similaire peuvent être obtenus en utilisant d’autres combinaisons de facteurs
- Déplacez le bras M/L-D/V du cadre stéréotaxique en place (au-dessus de l’animal) et fixez-le.
REMARQUE : Le cadre stéréotaxique permet d’ajuster la seringue le long de l’axe Antérieur/Postérieur (axe A/P, Y), Médial/Latéral (axe M/L, X), et l’axe dorsal/ventral (D/V, axe Z). - Déplacez la seringue le long des différents axes du cadre stéréotaxique pour amener l’extrémité du capillaire en verre juste au-dessus du bregma (le point de jonction où les différentes plaques crâniennes se rencontrent).
- Assurez-vous que l’embout capillaire est parfaitement droit dans les plans A/P et M/L. En cas de bregma ambigu, prendre la moyenne des sutures latérales et médianes.
- Lorsque l’extrémité du capillaire est correctement placée au-dessus du bregma, réinitialisez les valeurs M/L et A/P à 0,0 sur le compteur de coordonnées numérique.
- Pour vous assurer que la tête de l’animal est dans une position parfaitement plate, utilisez le compteur de coordonnées numériques pour mesurer la valeur des coordonnées D/V lorsque le bras A/P est à +2,0 et -2,0 (M/L = 0,0), ainsi que lorsque le bras M/L est à +2,0 et -2,0 (A/P = 0,0). Ajustez la hauteur de la barre de dent et des barres d’oreille en conséquence.
- Déplacez la seringue aux coordonnées souhaitées pour l’injection de vecteurs viraux dans le striatum (A/P = +1,0 ; M/L = -2,0, par rapport à bregma).
- Soulevez légèrement la seringue et, en regardant le site d’injection au microscope, percez un trou à l’aide d’une perceuse dentaire aux coordonnées d’injection. Commencez à forer sur le site, en travaillant de manière circulaire et douce.
REMARQUE : N’exercez pas trop de pression vers le bas, car le foret doit être suffisamment tranchant pour traverser l’os sans force supplémentaire. Évitez les forages longs et prolongés car cela crée de la chaleur. - A la fin du forage, vérifiez que la dure-mère reste intacte et exposée à l’injection.
- Préparation de la configuration de la seringue
- Placez un morceau de gaze de coton sur l’incision ouverte et rincez la seringue avec une solution saline.
- Après le rinçage, prélever une bulle d’air de 1 à 2 μL, suivie de 1 μL de solution contenant les vecteurs viraux, en évitant toute bulle involontaire. Assurez-vous que la solution virale peut être facilement visualisée sous la bulle d’air, pendant l’injection.
- Injection virale
- Retirez la gaze de coton du site d’incision et abaissez la seringue à l’aide du bras D/V du cadre stéréotaxique. Lorsque vous vous approchez de la surface du crâne, regardez attentivement au microscope et mesurez le niveau D/V de la dure-mère - elle doit légèrement gonfler sous une légère pression.
- Tout en touchant la dure-mère avec l’extrémité du capillaire, réglez la coordonnée D/V sur 0,0.
- Abaissez la seringue en progressant lentement jusqu’à la profondeur souhaitée (D/V = -2,7, par rapport à la dure-mère). Assurez-vous que la trajectoire est exempte de fragments d’os, de sorte qu’aucune flexion de l’aiguille/du capillaire ne soit observée.
REMARQUE : Les coordonnées présentées se réfèrent à une injection des facteurs de reprogrammation dans le striatum de souris NG2-Cre. Les coordonnées correspondant à d’autres régions du cerveau peuvent être utilisées. Testez toujours les coordonnées de l’injection en utilisant d’abord un colorant (par exemple, Trypan Blue), une injection de billes colorées ou un vecteur viral rapporteur avant d’injecter des facteurs de reprogrammation dans le cerveau d’une nouvelle souche de souris. Si l’on injecte du Trypan Blue, les animaux doivent être sacrifiés immédiatement après l’opération et le cerveau disséqué. Les cerveaux frais peuvent être coupés à l’aide d’un microtome, pendant qu’ils sont congelés, et le site d’injection peut être déterminé par la visualisation de la position du colorant dans le cerveau. Si l’on teste les coordonnées à l’aide de billes colorées, il est possible de déterminer le site d’injection sur les cerveaux perfusés et coupés une semaine après l’injection. Alternativement, une injection avec un vecteur viral porteur d’un gène rapporteur peut être utilisée, et le site d’injection déterminé dans les cerveaux coupés perfusés. - Injecter 1 μL de la solution virale à un débit de 0,4 μL/min. Lorsque tout le volume est injecté, prévoyez une période de diffusion de 2 min avant le retrait de la seringue.
- Après la diffusion, rétractez lentement la seringue jusqu’à ce que l’extrémité du capillaire soit complètement hors du cerveau.
- Placez un morceau de gaze de coton sur la plaie et rincez la seringue avec une solution saline.
- Déplacez le bras M/L-D/V du cadre stéréotaxique hors de la zone de travail.
- Fermeture de la plaie et procédures postopératoires
- Suturez soigneusement l’incision à l’aide de fil de suture.
REMARQUE : Tous les fils de suture utilisés chez les animaux injectés doivent être jetés dans une cupule/flacon contenant une solution détergente antivirale. La même solution est utilisée pour nettoyer toutes les surfaces entourant la zone chirurgicale qui ont été en contact avec des matériaux chirurgicaux. Tous les outils chirurgicaux sont soigneusement lavés et autoclavés à la fin de chaque journée d’opération. - Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans un poste postopératoire, qui comprend une cage propre et chauffée, un accès à de la nourriture et de l’eau, et où l’animal reste jusqu’à ce qu’il soit complètement réveillé. Pendant cette période, surveillez étroitement l’animal jusqu’à ce qu’il reprenne conscience.
- Ne logez pas d’animaux opérés avec des animaux non opérés jusqu’à ce que les premiers se soient complètement rétablis de la chirurgie.
- Surveillez quotidiennement les animaux opérés. En fonction des sutures utilisées, assurez-vous qu’elles sont retirées si nécessaire. Tous les animaux ont reçu du Bupenorphinum (Temgesic à 1 ml/kg) par voie sous-cutanée en tant que soins postopératoires.
REMARQUE : Si vous utilisez la même seringue pendant deux jours consécutifs, rincez-la avec de l’eau, puis de l’éthanol à 70 % et de l’eau à nouveau. Laissez la seringue remplie d’eau pendant la nuit pour permettre la dissolution de tout résidu éventuel.