Administration électrophorétique de GABA dans le foyer épileptique d’une souris anesthésiée

Résumé

Source : Slezia, A. et al. L’administration électrophorétique d’acide γ-aminobutyrique (GABA) dans un foyer épileptique prévient les convulsions chez la souris. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’administration électrophorétique d’acide gamma-aminobutyrique (GABA) pour inhiber l’activité convulsive chez une souris anesthésiée. Il décrit les étapes impliquées dans l’implantation de la sonde, l’enregistrement de l’activité neuronale, l’induction des crises et l’administration contrôlée de GABA via une pompe ionique microfluidique pour évaluer son efficacité thérapeutique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Chirurgie/craniotomie

1. Fixez la tête d’une souris anesthésiée dans un cadre stéréotaxique. À l’aide d’une aiguille de 30 g, injecter localement l’analgésique ropivacaïne (5 μL, 7,5 mg/mL, voir le tableau des matières) par voie sous-cutanée au site d’incision prévu. Attendez 5 min pour qu’il fasse effet.
2. Faites une ligne médiane de coupe droite dans la peau au-dessus du crâne avec un scalpel. Tirez doucement la peau vers les côtés avec des pinces fines et fixez-la de côté avec des pinces serrefine bulldog pour laisser le crâne exposé pour un travail ultérieur.
3. Nettoyez le crâne du fascia avec un scalpel ou tout autre outil similaire. En cas de saignement superficiel, prélevez le sang à l’aide de cotons-tiges ou de petits morceaux de papier absorbant.
4. Prenez une vis de terre recouverte de poly(3,4-éthylènedioxythiophène) polysulfonate de styrène (PEDOT :PSS) (taille : #00, diamètre : 0,047 po, longueur : 1/8 po, voir tableau des matériaux) avec un fil soudé et connectez-la avec un connecteur à la tête de l’amplificateur.
5. Humidifiez le crâne à l’endroit souhaité et percez un trou à grande vitesse à l’aide d’un foret fin et rond (d’un diamètre de 0,4 mm) sur le crâne au-dessus du cervelet jusqu’à ce que la dure-mère soit visible. Insérez la vis de terre dans le trou et vissez-la avec un tournevis de précision jusqu’à ce qu’elle atteigne le haut du cervelet.
   REMARQUE : La vis à tête a été enduite d’une solution de PEDOT :PSS contenant 1 % de 3-glycidyloxypropyl)triméthoxysilane (GOPS) en poids, suivie d’une cuisson à 140 °C pendant 90 min. PEDOT :PSS est un polymère conjugué avec une capacité volumétrique connue pour être biocompatible. GOPS est un agent d’interconnexion mélangé à PEDOT :PSS pour augmenter la stabilité dans les milieux aqueux (Figure 1).
6. À l’aide du cadre stéréotaxique, mesurez les coordonnées stéréotaxiques de la région cérébrale souhaitée. Par exemple, la région d’intérêt est l’hippocampe, antéropostérieur (AP) -1,8 mm et médiolatéral (ML) à 1,8 mm du point Bregma basé sur l’atlas cérébral pour les souris.
   REMARQUE : Il s’agit des coordonnées de l’hémisphère droit (Figure 1).
7. Éclaircir une zone d’environ 1 à 2 mm de diamètre du crâne au-dessus de la région cible à l’aide d’une perceuse dentaire fiable (voir tableau des matériaux) réglée à une vitesse rapide jusqu’à ce qu’il reste une membrane osseuse mince, bien polie et transparente.
8. Ensuite, si l’épaisseur de la membrane osseuse est suffisamment fine (<200 μm), faites un petit trou avec une pince fine et retirez délicatement la fine couche de l’os. Utilisez une aiguille à crochet faite sur mesure pour retirer la dure-mère. Réduire au minimum la taille de la craniotomie et de la durotomie afin de prévenir l’apparition d’œdèmes et de réduire au minimum les pulsations cardiaques et/ou respiratoires du cerveau.
   REMARQUE : La craniotomie doit être remplie d’une gouttelette de solution saline pour éviter le dessèchement, puis remplie régulièrement pendant l’expérience (Figure 1).

2. Insertion de la sonde en silicium multicanaux

1. Utilisez des bras stéréotaxiques dans un léger angle AP (20°) pour la sonde en silicium afin de laisser suffisamment d’espace pour le positionnement des deux autres implants et d’avoir les sites d’enregistrement et d’injection de l’électrode, de la pompe ionique et de la micropipette aussi proches que possible.
   REMARQUE : Les électrodes, les seringues et les pompes ioniques ont été recouvertes d’une goutte de solution de coloration DiI (perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine [DiI]), pour la visualisation post-hoc des traces d’implantation (0,5 mg/ml de DiI dans le sulfoxyde de diméthyle).
2. Placez la sonde en silicone sur le bras stéréotaxique fixé à un support magnétique et placez-la à côté du cadre stéréotaxique. Réglez l’angle AP (20°), puis connectez la sonde à la tête et à la vis de terre.
3. Abaissez lentement la sonde de silicium dans l’hippocampe à l’aide du bras stéréotaxique précis au micron près ou d’un micromanipulateur motorisé pour éviter les mouvements latéraux (Figure 1 et Figure 2).
   1. Lancez le logiciel d’enregistrement et enregistrez, avec la tête, l’amplificateur connecté et un ordinateur, les signaux neuronaux électriques tout en déplaçant la sonde multicanal en silicium du haut du cortex jusqu’à ce que la position dorso-ventrale (DV) ciblée soit atteinte (-1 800 μm de la surface corticale). Enregistrez et observez le signal de potentiel de champ local (LFP) pendant la pénétration sur l’écran de l’ordinateur.
      REMARQUE : Contrôlez la descente de la sonde de manière à ce qu’elle se déplace lentement et en continu pendant l’enregistrement, afin d’avoir un meilleur contrôle visuel de la pénétration et d’atteindre la zone cible.
   2. Utilisez l’activité d’ondulation dans la couche pyramidale de la formation de l’hippocampe dans le LFP enregistré comme marqueur de la zone cible.
      REMARQUE : L’activité d’ondulation est visible sur un ou deux canaux voisins de la sonde multicanal en silicium (Si) ayant une distance de 100 μm entre les sites d’enregistrement (Figure 3).
   3. Enregistrez simultanément les signaux LFP des couches du cortex et de l’hippocampe à travers le logiciel de l’amplificateur multicanal (voir le tableau des matériaux) à l’aide des sondes Si multicanaux (Figure 3).

3. Insertion d’une pompe ionique microfluidique (μFIP)

1. Connectez les tubes (voir Tableau des matériaux) à l’entrée du μFIP et remplissez la sonde avec une solution d’acide gamma-aminobutyrique (GABA) 0,05 M. Retirez les tubes et fermez l’entrée avec un film de paraffine. Connectez les fils électriques à l’unité de mesure de la source.
2. Insérez le μFIP à l’aide du bras stéréotaxique à un angle médiolatéral (MP) (20°). La sonde Si reste insérée pendant tout le processus.
   REMARQUE : La FIP est très flexible et peut bénéficier de l’aide d’un petit pinceau propre pour la maintenir droite jusqu’à ce qu’elle atteigne la surface du cerveau. Après cette étape, la μFIP peut être abaissée doucement avec des mouvements axiaux.
3. Abaissez lentement le μFIP avec des mouvements axiaux et ne le laissez jamais se plier pendant la trajectoire jusqu’à ce qu’il atteigne la coordonnée dorso-ventrale (DV) (-1 200 μm de la surface corticale).
   REMARQUE : Essayez de placer les deux appareils (μFIP et sonde en silicium) aussi près l’un de l’autre que possible, compte tenu de la distance de 300 μm entre la sortie et l’embout μFIP.
   ATTENTION : Évitez tout problème mécanique entre les appareils et leurs connecteurs lors de l’insertion (Figure 1B et Figure 2B).

4. Préparation des dispositifs pour l’induction des crises

1. Changer l’aiguille métallique de la seringue (10 μL) (voir le tableau des matériaux). Retirez la partie métallique porte-aiguille, placez et fixez la micropipette (diamètre extérieur [OD] : 1,2 mm, diamètre intérieur [ID] : 0,75 mm, diamètre de l’embout : 20 à 50 μm avec ± 0,5 cm d’effilage de la tige), puis replacez l’élément porte-aiguille.
2. Positionnez la seringue et la micropipette en borosilicate attachée à un angle latéromédial (LM) de 20° pour l’injection de 4-aminopyridine (4AP) (50 mM dans du liquide céphalo-rachidien artificiel [ACSF]).
   ATTENTION : N’utilisez pas l’aiguille métallique de la seringue ou une micropipette dont l’embout est supérieur à 50 μm.
3. Tirez 500 nL–1 μL de 50 mM 4AP à l’aide d’une pompe de micro-injection automatisée.

5. Insertion de la pipette en verre fixée à une seringue pour l’injection 4AP

1. Abaissez la micropipette en verre fixée à la seringue à la position DV visée (-1 500 μm), puis injectez 250 nL de la solution 4AP (Figure 1 et Figure 2). Démarrez l’enregistrement avec le logiciel d’enregistrement. Regardez l’écran et attendez que le premier pic interictal apparaisse.
2. Commencer l’administration de GABA par μFIP dès l’apparition du premier pic interictal. Diffusez du GABA en appliquant 1 V entre la source et la cible pendant 100 s, puis 1 s d’arrêt pendant 30 cycles. À l’aide du logiciel d’enregistrement, enregistrez pour un minimum de 2 h.
   REMARQUE : La masse totale du GABA délivré est d’environ 1 nmol (Figure 4).
3. À la fin de l’expérience, retirez délicatement les sondes insérées et la vis de terre, et retirez l’animal de l’équipement stéréotaxique. Les animaux ont été euthanasiés à l’aide d’une surdose de médicament (100 mg/kg de pentobarbital). La mort a été confirmée par l’arrêt de la respiration et de la circulation.

Résultats

Figure 1 : Cranio-durotomie et localisation des implants dans le cerveau de la souris. (A) Vue schématique de l’opération, de la craniotomie et de la cible des implants dans le cerveau de la souris. (B

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4AP	Sigma	275875
Amplifier	Neuralynx, Montana, USA	Digital Lynx 4SX
Amplifier	Ampliplex	KJE-1001
Atlas Stereotaxique	Allen Atlas	978-0470054086
Pipette en verre borosilica	Sutter	BF120-69-15
Brain Matrix	WPI	RBMA-200C
Tondeuse osseuse	FST	16109-14
Connecteur	INSTECH	SC20/15
Coton tige	Monoprix	EMD 6107OD
Couvre-lame	Menzel-Glass	15747592
DiI Stain	Thermo Fisher	D282
DMSO	Sigma	11412-11
Foret	FOREDOM	K1070
Pince	F.S.T.	11412-11
GABA	Sigma	A2129
GOPS	Sigma	440167-100M
Seringue Hamilton	Hamilton	80330
Vis de tête	Alimentation en composants	TX00-2FH
Coussin chauffant	Appareil Harvard	341446
Pompe	d’injectionWPI	UMP3-3
Keithley	Tektoronix	216A
Kétamine	Renaudin	5787419
Support magnétique	Narishige	GJ-1
Souris	Charles River	612
Manipulateur moteur	Scientifica, UK	IVM
Hydrogène disodique phosphate	Sigma	255793
Dihydrogénophosphate monosodique	Sigma	7558807
NeuroTrace DiI	Thermofisher	N22880
Essuie-tout	KIMBERLY CLARK	7552000
PB	Sigma	P4417
PEDOT :PSS	CLEVIOS		81076212
PFA	Acros Organic	30525-89-4
Sonde de température rectale	Appareil Harvard	521591
Ropivacaïne	KABI	1260216
Saline	Sigma	7982
Scalpel	F.S.T	AUST
Seringue	BD	Medical 324826
Serrefine clamp	F.S.T	18050-28	4 est recommandé
Sonde en silicone	NeuroNexus, Michigan, USA	A2x16-10mm-50-500-177 ou A1x16-5mm-150-703
Cadre stéréotoxique	Stoelting	51733U
Xylazine	Bayer	4007221032311

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