Visualisation des réseaux neuronaux et vasculaires dans un embryon de poulet

Dans cet article

Résumé

Source : Delalande, J., et.al. Double marquage des cellules de la crête neurale et des vaisseaux sanguins dans les embryons de poulet à l’aide d’une greffe de tube neural^GFP de poulet et d’une injection de colorant de carbocyanine DiI. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo montre la transplantation d’un tube neural de donneur marqué à la GFP à partir d’un embryon de poulet transgénique apparié à un embryon receveur au niveau des somites un à sept, suivie d’un marquage vasculaire à l’aide d’un colorant fluorescent lipophile. L’approche combinée permet de visualiser directement l’embryon sous un microscope à stéréofluorescence, ce qui permet d’étudier l’intégration du greffon neural et le développement du réseau vasculaire in ovo.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Greffez le tissu À l’aide

d’une micro-pipette en verre, transférez soigneusement le tube neural disséqué du verre de la montre à l’embryon hôte. Positionnez le tube neural dans la bonne orientation antéro-postérieure et poussez doucement l’explant adjacent à la région excisée de l’hôte poussin à l’aide du micro-scalpel. Laissez un petit fragment d’ectoderme attaché à la surface dorsale ou en coupant une petite entaille dans celle-ci pour identifier l’orientation du tube neural.
1. Si nécessaire, utilisez le micro-scalpel pour couper l’explant à la taille exacte de la région excisée.
Guidez doucement le tube neural dans la région ablatée et positionnez-le de manière à ce que la face dorsale soit correctement orientée. À l’aide d’une micropipette en verre, montée sur un tube buccal, on peut prélever le PBS et/ou le liquide entourant le greffon. Cela aide les tissus du donneur et de l’hôte à adhérer et le greffon à s’établir.
Scellez toute la fenêtre avec du ruban adhésif transparent de 24 mm de large pour éviter la déshydratation et la contamination.
Étiquetez l’embryon chimérique en marquant avec un crayon sur la coquille de l’œuf et notez son numéro dans le cahier de laboratoire. Retournez l’œuf dans l’incubateur pour un développement ultérieur.

2. Injectez du DiI dans les vaisseaux sanguins de l’embryon hôte

Au moment expérimental souhaité (ici, 3 à 10 jours plus tard), récupérez l’embryon chimérique de l’incubateur et retirez le ruban transparent à l’aide de ciseaux droits pour accéder à l’embryon dans l’ovule.
Si nécessaire, agrandissez la fenêtre dans la coquille à l’aide des ciseaux. Attention à ne pas endommager la membrane chorioallantoïdienne si elle est attachée à la coquille, ce qui entraînerait une hémorragie et compromettrait l’étiquetage des vaisseaux sanguins.
Choisissez une veine accessible sur le jaune en vous assurant que le flux sanguin est dirigé vers l’embryon. Choisissez un point de ramification de l’une des veines vitellines (Figure 1B, C).
REMARQUE : Aux niveaux E6.5 - E7.5, il peut être nécessaire d’écarter doucement la membrane chorioallantoïdienne à l’aide d’une pince à épiler pour accéder aux veines vitellines. Après E8.5, la seule option est d’injecter dans l’une des veines de la membrane chorioallantoïdienne puisque, à ce stade, la membrane chorioallantoïde recouvre entièrement l’embryon.
Retirez la membrane vitelline au-dessus du point d’injection choisi à l’aide de deux pinces Dumont #5 en déchirant dans des directions opposées.
Cassez une aiguille de verre tirée à l’aide d’un Dumont #5 et ajustez son diamètre à la taille approximative de la veine avant de la charger avec le CellTracker CM-DiI. Préparez la solution mère de DiI à 40 μg/μl dans du DMSO et conservez-la à -20 °C. Préparez la solution de travail dans du saccharose 0,3 M/PBS à une concentration de 4 μg/μl.
1. Aspirez entre 5 et 10 μl de DiI dans du saccharose/PBS 0,3 M dans l’aiguille en utilisant l’aspiration avec un tube buccal. Les embryons plus âgés peuvent nécessiter jusqu’à 25 μl ou plus. À partir de E8.5, les embryons ont des veines plus grandes et plus musclées, qui peuvent avoir besoin d’être maintenues en position avec un Dumont #5 avant de poignarder avec l’aiguille de verre chargée de DiI.
Insérez rapidement l’aiguille dans la veine et soufflez régulièrement avec le tube buccal pour permettre au DiI de rejoindre lentement le flux sanguin sans former de caillot. Vous pouvez également utiliser un injecteur de pression pour l’administration de DiI.

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Résultats

Figure 1. Injection intraveineuse de DiI. (A) Instruments recommandés : a) CellTracker CM-DiI goutte sur parafilm, b) aiguille d’injection de verre tiré, c) tube buccal. (B) Schéma de principe de l’injection intraveine...