Imagerie in vitro en temps réel de la ramification axonale dans les neurones corticaux de souris

Résumé

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une technique d’imagerie en direct utilisant la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer en temps réel la ramification axonale dans les neurones corticaux. Des vidéos en accéléré capturent les effets du traitement par la nétrine-1, une molécule de signalisation qui induit une exocytose localisée et des réarrangements cytosquelettiques dans les axones. Ces processus initient des protubérances membranaires, qui se transforment en branches axonales matures, fournissant des informations sur le développement neuronal.

Protocole

1. Microscopie time-lapse à contraste interférentiel différentiel (CID) de la ramification axonale

Remarque : Bien que ce protocole utilise la CID, d’autres méthodes de microscopie à lumière transmise peuvent être utilisées aux mêmes fins (par exemple : contraste de phase).

1. À 2 jours in vitro (DIV), placez une parabole d’imagerie à fond de verre contenant des neurones non transfectés dans une chambre environnementale préchauffée pour maintenir un environnement humide avec 5 % de CO2 et 37 °C. Utilisez un microscope équipé d’un objectif Plan-Apochromat 60X, d’un objectif DIC à ouverture numérique (NA) de 1,4 et d’un condenseur à grande ouverture numérique pour une qualité d’image et une résolution optimales.
2. Ajustez le plan focal pour trouver les neurones à travers les oculaires à l’aide de l’éclairage en lumière transmise.
3. À l’aide de la fonction d’acquisition multizone du logiciel d’imagerie, recherchez et enregistrez les emplacements XYZ d’au moins 6 cellules. Positionnez la platine de manière à ce que les neurones d’intérêt s’insèrent dans le champ de vision pour de meilleurs résultats.
   1. Stimulez avec 250 ng/ml de nétrine-1 et appuyez sur 'démarrer l’acquisition multi-zones'. Acquérez séquentiellement des images à chaque position toutes les 20 secondes pendant 24 heures, en interrompant l’acquisition et en refaisant la mise au point si nécessaire.
4. Examiner les images dans un logiciel d’imagerie à l’aide d’Apps>Examiner les données multidimensionnelles>ouvrir le nom du fichier. Identifier les branches axonales stables (20 m de long) qui se forment lors de la séance d’imagerie. Utilisez l’outil de dessin de ligne pour mesurer une branche axonale stable de la base de l’axone à la pointe afin de vous assurer que la qualification de longueur de 20 μm est respectée.
   1. Dans une feuille de calcul, notez le numéro de cadre après la stimulation de la nétrine lorsque les protubérances membranaires commencent dans les zones où les branches se forment plus tard, ainsi que le numéro de l’image après la stimulation de la nétrine lorsque les branches naissantes atteignent 20 μm de longueur.
   2. Multipliez le nombre d’images entre la saillie et la formation de la branche par 20 secondes pour calculer le temps de formation par branche.

Matériaux