Imagerie in vivo à deux photons de la dynamique microgliale dans l’hippocampe de souris

Résumé

Source : Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocamp. J. Vis. Exp. (2022)

La vidéo montre la configuration et le processus d’imagerie pour la microscopie à deux photons in vivo de la dynamique microgliale dans l’hippocampe CA1 (Cornu ammonis 1) et le gyrus denté, assurant un alignement optique optimal et une évaluation de l’intégrité structurelle.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. In vivo, imagerie chronique à deux photons de la microglie à l’aide de souris CX3CR1-GFP

1. Après l’induction de l’anesthésie, laver l’intérieur du tube métallique avec une solution saline stérile pour éliminer les débris. Assurez-vous que l’alvéus blanc de l’hippocampe est visible à travers le verre (Figure 1A) et qu’il n’y a pas de complications, telles que des saignements postopératoires.
2. Placez la souris sous le microscope à deux photons en procédant comme suit :
   1. Placez la souris dans le dispositif de maintien de la tête sous l’objectif du microscope à deux photons et sur la platine de balayage XY motorisée. Utilisez un coussin chauffant pour le soutien thermique. Surveillez et ajustez la profondeur de l’anesthésie, car ce contrôle de qualité peut prendre jusqu’à 30 minutes. note: Il est recommandé d’utiliser un objectif à immersion dans l’eau avec une distance de travail (WD) supérieure à 3 mm et une ouverture numérique (NA) élevée. Une bague de correction de la lentille de l’objectif peut améliorer la résolution en compensant le décalage de l’indice de réfraction entre le verre et les biomatériaux.
   2. Remplissez d’eau l’espace entre le verre et la lentille de l’objectif, en prenant soin d’éviter les bulles d’air. Si nécessaire, élargissez la zone de la plaque métallique à l’aide d’un film plastique, qui retient plus d’eau, pour couvrir toute la lentille frontale de l’objectif.
   3. Allumez un laser pulsé femtoseconde de longueur d’onde de 920 nm pour l’excitation des sondes fluorescentes exprimées dans le cerveau et démarrez le logiciel d’acquisition d’images.
   4. Ajustez la mise au point sur le CA1 (Cornu Ammonis 1) à l’aide de la platine motorisée et du système de mise au point motorisée. Positionnez la structure cible en guidant la fluorescence émise par le parenchyme cérébral et la lumière réfléchie par le bord du tube métallique sous un éclairage continu par le laser pulsé.
   5. Mesurez les profondeurs du parenchyme cérébral touchant le fond du verre en ajustant la mise au point avec le système de mise au point motorisé. Comparez les profondeurs à différents endroits horizontaux pour juger de l’alignement du fond de verre et du plan d’imagerie.
      1. Ajustez l’angle de la tête de la souris en inclinant le dispositif de maintien de la tête jusqu’à ce que le fond en verre soit parallèle au plan d’imagerie.
   6. Ajustez le collier de correction de l’objectif pour obtenir la résolution la plus élevée à la profondeur de la structure cible dans le CA1.
3. Vérifiez la qualité et l’intensité des images obtenues par excitation biphotonique de l’hippocampe (Figure 1B).
   REMARQUE : La détérioration de l’image indique la présence de lésions tissulaires à l’intérieur du cerveau.
4. Assurez-vous que les microglies ont déjà récupéré leur morphologie ramifiée (Figure 1C).
   REMARQUE : Les données d’imagerie des microglies indiquent qu’il faut au moins 3 à 4 semaines pour que les microglies reviennent à leur état basal.
5. Effectuer une imagerie in vivo dans n’importe quelle couche du CA1 dans le but particulier de l’expérience.

Résultats

Figure 1 : Imagerie in vivo de la microglie chez des souris CX3CR1-GFP en phase chronique.) L’aspect représentatif de la fenêtre implantée sur la DA1 dorsale droite (Cornu Amm...

Matériaux