Imagerie des transitoires calciques rapides dans les terminaisons nerveuses de souris à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

Source : Zhilyakov, N. V. et. al., Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle à l’aide de la microscopie confocale. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre la technique d’imagerie permettant d’enregistrer les transitoires calciques rapides au niveau des terminaisons nerveuses à l’aide de la microscopie confocale. En stimulant le nerf et en capturant les changements de fluorescence des colorants liant le calcium, il visualise l’afflux dynamique de calcium et sa clairance à la terminaison nerveuse, offrant ainsi des informations précises sur l’activité synaptique et la signalisation neuromusculaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

Des expériences ont été réalisées sur des préparations nerveuses-musculaires isolées de releveur de l’auris longus (m. LAL) chez les souris BALB/C (20-23 g, âgées de 2-3 mois).

1. Préparation des solutions de Ringer et de limage

1. Préparez la solution de Ringer pour le muscle de mammifère en mélangeant les ingrédients suivants : chlorure de sodium, NaCl (137 mM), chlorure de potassium, KCl (5 mM), chlorure de calcium, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) et glucose (11 mM). Faites bouillir la solution avec 95 % d’oxygène (O₂) et 5 % de dioxyde de carbone (CO₂) et ajustez son pH à 7,2-7,4 en ajoutant de l’acide chlorhydrique/hydroxyde de sodium (HCl/NaOH) si nécessaire.
2. Préparez la solution de chargement du colorant.
   1. Préparez une solution d’acide (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) (10 mM) avec un pH compris entre 7,2 et 7,4. 500 μg de colorant commercial sont présentés dans un flacon de 500 μL. Dissoudre le colorant dans 14 μL de la solution HEPES pour obtenir une concentration de colorant de 30 mM. Bien agiter et centrifuger jusqu’à dissolution totale.
   2. Diluer la solution de l’indicateur Ca²⁺ avec la solution d’HEPES jusqu’à une concentration de 1 mM. Conservez-le au congélateur (-20 °C) et évitez l’exposition à la lumière.

2. Procédure de chargement du colorant

REMARQUE : La procédure de chargement du colorant est effectuée conformément au protocole de chargement par le moignon nerveux, adapté des protocoles précédemment publiés.

1. Disséquer le muscle LAL selon la procédure de dissection de cette préparation, telle que décrite dans les protocoles précédemment publiés.
   1. Fixez le tissu légèrement étiré (pas plus de 30 % de la longueur initiale) dans la boîte de Pétri recouverte d’élastomère à l’aide de fines broches en acier inoxydable et ajoutez la solution de Ringer jusqu’à ce que le muscle soit complètement recouvert.
      REMARQUE : La boîte de Pétri a été pré-remplie d’élastomère conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. Préparez la pipette de remplissage
   1. À l’aide d’un extracteur de micropipette (voir tableau des matériaux), préparez une micropipette avec une pointe fine et aussi tranchante que possible pour les enregistrements intracellulaires. Utilisez des capillaires sans filaments internes (1,5 mm de diamètre extérieur et 0,86 ou 1,10 mm de diamètre intérieur).
   2. Cassez la pointe de la micropipette après avoir entaillé le cône avec un abrasif, en laissant la pointe ouverte sur environ 100 μm de diamètre. Polissez au feu la pointe vers le bas jusqu’à ce que le diamètre interne passe de >80 μm à 12-13 μm. Fixez un tube en silicone d’un côté de la pipette de remplissage et une seringue (sans aiguille) de l’autre côté.
3. Au microscope stéréoscopique, trouvez l’endroit où le tronc nerveux se transforme en branches nerveuses séparées. Placez la pipette de remplissage avec le tube monté et la seringue sur la boîte de Pétri à l’aide de cire. Déplacez la pointe de la pipette jusqu’à ce qu’elle se trouve au-dessus du nerf.
4. Avec des ciseaux fins, coupez le nerf près de la fibre musculaire, en laissant un petit morceau du moignon du nerf d’environ 1 mm de long. Aspirez doucement le moignon nerveux avec un peu de solution de Ringer, sans le pincer, dans l’extrémité de la pipette de remplissage. Retirez le tube en silicone de la pipette de remplissage.
5. Prélever une certaine quantité de la solution de chargement du colorant (~0,3 μL) à l’aide d’une seringue à filament long. Ce volume correspond à environ 3 cm du filament.
   REMARQUE : Dans un premier temps, il est nécessaire de fabriquer un filament à partir d’une pointe de pipette d’un volume de 10 μL en tirant sur le feu à l’aide d’une lampe à alcool ou d’un brûleur à gaz.
6. Insérez délicatement l’embout du filament avec la solution de chargement dans la pipette de remplissage. Libérez le mélange directement sur le moignon nerveux. Incuber la préparation à température ambiante dans l’obscurité pendant 30 min.
7. Après cela, rincez la préparation avec la solution fraîche de Ringer et incubez à 25 °C jusqu’à 2 h dans un bécher en verre avec 50 ml (ou plus) de solution de Ringer (la préparation doit être recouverte de la solution). Pendant ce temps, le colorant atteindra les synapses.

3. Capture vidéo avec microscopie confocale

REMARQUE : L’enregistrement des transitoires calciques est effectué à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser (LSCM) (voir le tableau des matériaux). Pour enregistrer les transitoires calciques rapides, un protocole original permettant d’enregistrer des signaux avec une résolution spatiale et temporelle suffisante a été utilisé. Le microscope était équipé d’un objectif à immersion dans l’eau 20x (ouverture numérique (NA) de 1,00). La ligne laser de 488 nm a été atténuée à une intensité de 10 % et la fluorescence d’émission a été collectée de 503 à 558 nm.

1. Montez la préparation dans la chambre d’expérimentation recouverte d’élastomère de silicium et fixez-la, légèrement étirée, à l’aide d’un ensemble de micro-aiguilles en acier. Rincer abondamment la préparation avec la solution de Ringer.
   REMARQUE : Une chambre expérimentale de perfusion simple et sur mesure, en verre organique, dont le fond est recouvert d’un élastomère (préparé conformément aux instructions du fabricant ; voir le tableau des matériaux) a été utilisé. La chambre est équipée d’un tube d’alimentation en solution. La solution est pompée à l’aide d’une aiguille de seringue, montée sur un support magnétique (voir tableau des matériaux). En tant que chambre expérimentale, une boîte de Pétri pourrait être utilisée (comme celle utilisée pour l’incubation de la préparation), mais avec des tubes d’alimentation et d’aspiration attachés.
2. Installez une électrode d’aspiration, qui sera utilisée pour stimuler le nerf.
   REMARQUE : Placez et fixez l’électrode en la cirant à côté du bain. Déplacez l’embout près du moignon nerveux et aspirez-le dans l’électrode.
3. Montez la chambre de préparation sur la platine du microscope et placez les raccords d’entrée et de sortie dans la chambre.
4. Pour réaliser la préparation, utilisez un système simple entraîné par gravité. Allumez la pompe d’aspiration à perfusion pour éliminer l’excès de solution.
5. Branchez l’électrode d’aspiration stimulante sur un stimulateur électrique et assurez-vous que des contractions musculaires se produisent après la stimulation. Voir rubriques 3.9-3.12 pour les conditions de stimulation et l’enregistrement.
6. Remplissez le système de perfusion avec la solution de Ringer avec de la d-tubocurarine (10 μM).
   REMARQUE : Cette solution aide à prévenir les contractions musculaires. Les inhibiteurs spécifiques de la D-tubocurarine ou de l’alpha-bungarotoxine des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine sur la membrane postsynaptique bloqueraient complètement ou partiellement les contractions musculaires50. De plus, pour prévenir les contractions musculaires, des bloqueurs spécifiques des canaux sodiques postsynaptiques tels que la μ-conotoxine GIIIB pourraient être utilisés51.
7. Allumez la pompe d’aspiration de perfusion et commencez la perfusion de la préparation avec la solution de Ringer contenant de la d-tubocurarine.
8. Réglez les paramètres d’imagerie dans le logiciel LSCM comme suit.
   1. Dans le logiciel LSCM (LAS AF ; voir Tableau des matériaux), choisissez Electrophysiology.
      REMARQUE : Dans ce mode, lorsqu’une image est capturée au point temporel, une impulsion de synchronisation est envoyée au stimulateur à l’aide de la boîte de déclenchement. Cela suscite la génération d’un potentiel d’action dans la préparation (Figure 1 ; unité de stimulation).
   2. Sélectionnez Mode d’acquisition. Pour déclencher le stimulateur à l’aide de l’impulsion de synchronisation du microscope, dans les paramètres du menu Job, sélectionnez les paramètres de déclenchement. Réglez le champ Trigger Out On Frame sur le canal out1.
   3. Utilisez les paramètres suivants : Mode de balayage : XYT, Fréquence de balayage : 1400 Hz, Facteur de zoom : 6,1, Sténopé : complètement ouvert. Assurez-vous que le mode X bidirectionnel séquentiel est activé.
   4. Définissez le temps minimum de formation d’une image à 52 ms et le nombre d’images à collecter dans une vidéo brute à 20 images.
      REMARQUE : ces paramètres permettent de capturer des images avec une résolution de 128 x 128 pixels tout en prenant une seule image toutes les 52 ms.
   5. Réglez la longueur d’onde d’excitation du laser à argon à 488 nm avec 8 % de la puissance de sortie.

Appuyez sur le bouton Live Mode pour passer en mode Live, ce qui permet d’obtenir un aperçu des terminaisons nerveuses chargées avec le colorant.

9. Unité de stimulation
   REMARQUE : Cet appareil permet de définir les paramètres temporels de la stimulation via le logiciel MATLAB.
   1. Créez un nouveau fichier, collez le code de l’article mentionné ci-dessus dans la fenêtre de code MatLab et enregistrez le fichier. Cliquez sur Exécuter, pour qu’une fenêtre avec les paramètres de stimulation apparaisse. Réglez le temps de retard et la durée du stimulus.
      REMARQUE : Le retard détermine la résolution temporelle du signal fluorescent reconstitué. L’impulsion électrique d’une durée de 0,2 ms est retardée puis envoyée à l’unité d’isolement. Ce dernier forme l’amplitude et la polarité de l’impulsion de stimulation et isole électriquement l’objet biologique de l’appareil d’enregistrement.
   2. Pour stimuler le nerf, sélectionnez l’amplitude supramaximale de l’impulsion stimulante (25 % à 50 % supérieure à l’intensité de stimulation maximale nécessaire pour activer toutes les fibres nerveuses).
      REMARQUE : La méthode présentée est basée sur un algorithme spécial pour l’enregistrement de signaux fluorescents rapides uniques à l’aide de LSCM avec balayage minimisé. À chaque étape de l’algorithme développé, le signal fluorescent enregistré est décalé par rapport au précédent d’un intervalle de temps plus court que le balayage du microscope. La valeur des décalages temporels détermine la résolution temporelle du signal requis. Le nombre d’étapes (décalages) dans l’algorithme dépend de la résolution temporelle requise et de la résolution temporelle d’origine. Avec cette méthode de recalage, la stimulation de la préparation est effectuée à une fréquence de 0,25 Hz.
10. En mode Live, recherchez le ROI et obtenez le meilleur focus. Exécutez le logiciel d’acquisition de données.
11. Décalez le retard du stimulateur de 2 ms de moins par rapport à la valeur précédente et exécutez le logiciel d’acquisition de données.
12. Répétez l’étape 3.11 26 fois pour acquérir 26 séquences, chaque séquence étant décalée de 2 ms par rapport à la précédente.

Résultats

Figure 1 : Le schéma de la configuration expérimentale. 1. Microscope confocal à balayage laser (LSCM). 2. Module de synchronisation de LSCM (boîte de déclenchement). 3. Stimulateur. 4. Unité d’isolement. 5. L’échantillon biologique. 6. Électrod...

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