Évaluation du traitement au plasma à pression atmosphérique dans les cellules de neuroblastome privées de glucose

Résumé

Source : Yan, X., et. al., New Application of a Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells. J. Vis. Exp. (2017)

La vidéo démontre l’activité neuroprotectrice du traitement au plasma à pression atmosphérique à faible dose dans les cellules de neuroblastome privées de glucose en modulant le stress oxydatif et en améliorant la viabilité cellulaire.

Protocole

1. Traitement APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet) de SH-SY5Y

1. Ajustez la distance entre la buse du tube de quartz et la plate-forme où la plaque de 96 puits sera placée à 3 cm. Assurez-vous que le faisceau peut toucher la surface du milieu de culture.
   REMARQUE : La distance n’est pas mesurée à partir du bas de la plaque. Il est d’abord ajusté à 3 cm entre la buse du tube de quartz et la plate-forme utilisée pour placer la plaque de 96 puits.
2. Avant le traitement APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet), changer le milieu de culture dans chaque puits sauf les puits de contrôle en RPMI 1640 sans milieu glucose.
3. Placez la plaque sous la buse APPJ et assurez-vous que les jets peuvent tirer verticalement dans chaque puits.
4. Traitez les cellules dans des puits séparés avec APPJ pendant 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s et 12 s.
   REMARQUE : L’APPJ est généré par l’hélium ionisant (Figure 1). Les cellules lésées par la privation de glucose sont traitées par un flux d’hélium de 4 s et 8 s pour éliminer les effets de l’hélium sur les cellules. Tous les traitements doivent être effectués en trois exemplaires.

2. Test de viabilité cellulaire

REMARQUE : Ne changez pas de milieu à cette étape.

1. Après le traitement APPJ, incubez les cellules pendant 1 h dans un incubateur cellulaire.
2. Ajouter 10 μL de solution du Kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8) dans chaque puits.
3. Incuber les cellules à 37 °C pendant 4 h
   REMARQUE : La lignée cellulaire SH-SY5Y est sensible aux conditions de privation de glucose. La viabilité cellulaire diminue à près de 50 % après 1 heure de privation de glucose, ce qui est la condition optimale de viabilité cellulaire pour les études pharmacodynamiques. CCK-8 n’a pas de cytotoxicité pour les cellules, et les cellules sont incubées avec le réactif CCK-8 pendant encore 4 heures dans les conditions de privation de glucose après le traitement par APPJ pour vérifier la viabilité cellulaire. Après 8 h de privation de glucose et de traitement par APPJ, l’effet protecteur d’APPJ a été considérablement réduit car la longue durée de privation de glucose a entraîné de graves dommages aux cellules SH-SY5Y. Il n’y avait aucune preuve de cellules vivantes après 24 h de privation de glucose.
4. Mesurez l’absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques.

Résultats

Figure 1 : Réactions typiques RNS (espèces réactives de l’azote) et ROS (espèces réactives de l’oxygène) dans les émissions APPJ (Atmospheric Pressure Plasma Jet).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
SH-SY5Y lignée cellulaire	China Center for Type Culture Collection	3111C0001CCC000026
RPMI 1640 medium	Thermo Scientific	21875091	Stocké à 4 °C
RPMI 1640 medium sans glucose	Thermo Scientific	11879020	Stocké à 4 °C
Sérum de veau fœtal	Thermo Scientific	16000044	Stocké à -20 °C
Plaque 96 puits	corning	3599
Cell Counting Kit-8 (CCK-8)	Dojindo Laboratories	CK04	Stocké à 4 °C
Lecteur de microplaques	Tecan	M200 Pro	Pour mesurer l’absorbance à 450 nm
Amplificateur de puissance haute tension	Trek	PD06087	Pour amplifier la
puissance Fonction Générateur de signal	MaZe Electronics Science &	AT30120	Pour fournir le signal spécifique
Sonde haute tension	Tektronix	P6015A	Pour détecter la haute tension
Oscilloscope numérique	Tektronix DPO4104B		Pour afficher le signal