Administration intranasale de siRNA dans le cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement

Résumé

Source : Ullah, I., et.al. Dispositif de positionnement pour le placement de souris lors de l’administration intranasale d’ARNi au système nerveux central. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre une technique d’administration intranasale précise pour délivrer des complexes peptide-siRNA ciblant les neurones au cerveau de la souris à l’aide d’un dispositif de positionnement spécialisé. Les souris anesthésiées sont fixées en position tête baissée et avancée pour optimiser l’inhalation de siRNA tout en empêchant le drainage pulmonaire. Le peptide de ciblage facilite l’absorption médiée par le récepteur dans les neurones, permettant l’administration ciblée de siRNA et le silençage génique dans le cerveau.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Positionnement de la souris

1. Évaluer le niveau d’anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l’orteil) pour maintenir le plan chirurgical.

2. Placez le dispositif de positionnement à une distance et à une hauteur appropriées afin de permettre un accès pratique à tous les réactifs requis.

3. Une fois que les souris sont correctement anesthésiées, soulevez doucement chaque souris par la peau de son cou avec le pouce et l’index et placez-la sur la chaise désignée.

4. Le bon positionnement de la souris sur la chaise est très important à ce stade. Posez le dos de la souris parallèlement au support dorsal de la chaise, et à 90° par rapport à l’assise de la chaise. Soulevez les mains de la souris et laissez l’animal s’allonger naturellement en position tête baissée et avancée, sans pousser ni appuyer, comme le montre la figure 1B. Assurez-vous que les membres antérieurs de la souris offrent un soutien naturel pendant que l’animal est dans cette position détendue, sans aucune gêne pour la souris.

5. Une fois que les souris sont correctement positionnées, attachez-les avec la ceinture de la chaise et commencez immédiatement l’inoculation intranasale.

2. Administration intranasale (IN)

REMARQUE : Ce protocole décrit l’administration IN des complexes RVG9R :siRNA à l’aide du dispositif de positionnement de la souris. En utilisant ce protocole, un maximum de 20 à 30 μL de solution peut être facilement administré à chaque souris en gouttes de 2 μL. Ce volume est inférieur à celui de la cavité nasale de la souris, qui est de 0,032 cm³, de sorte que la procédure n’entraîne pas d’obstruction mortelle des narines ou d’asphyxie. Ce protocole permet l’inoculation simultanée d’au moins quatre souris et d’un maximum de huit souris par dispositif, ce qui permet d’optimiser le temps et de réduire la variabilité.

1. Prenez la micropipette de 10 μL et ajustez-la à 2 μL.

2. Chargez la micropipette avec 2 μL de solution complexe RVG9R :siRNA (par exemple, 5,2 μg de siCy5 complexé avec 104 μg de RVG9R pour l’expérience d’administration, et 13,5 μg de siSOD1 complexé avec 270 μg de RVG9R pour l’expérience de silençage, dans un volume final de 25 μL de PBS contenant 5 % de glucose.

3. Tout en tenant la pipette dans la main dominante, ajustez la position en plaçant un coude sur le dessus de la paillasse. Soutenez la main qui tient la pipette avec l’autre main pour éviter les mouvements incontrôlés pendant l’administration.

4. Placez une goutte de ~2 μL très près d’une narine afin que la souris puisse inhaler directement la gouttelette (reportez-vous à la Figure 1B). Si une petite goutte ne se forme pas facilement, remplacez la pointe de la pipette par une nouvelle et répétez l’opération. Utilisez le chronomètre pour vérifier l’intervalle de temps entre les inoculations.

5. Cet appareil permet de traiter au moins quatre souris à la fois. Si un autre groupe de souris doit répéter l’étape 2.4, placez une autre barre avec quatre chaises au-dessus ou en dessous de la première barre avec quatre chaises pour accueillir jusqu’à huit souris à la fois sur l’appareil.

6. Répétez l’étape 2.4 avec l’autre narine 3-4 min après la première inoculation. Cet intervalle de temps est suffisant pour que la souris termine l’inhalation de la première dose et rétablisse une respiration normale. Si une goutte de la solution inhalée est délogée en raison d’un reniflement accidentel de la narine de la souris, réinoculez 2 μL supplémentaires de solution.

7. Répétez tout le processus avec des narines alternées jusqu’à ce que la dose de 20-30 μL soit terminée. Il faudra ~30-45 minutes pour terminer toute la procédure d’inoculation.

8. Mettez de la pommade humide sur les yeux des souris avant de les remettre dans leurs cages désignées.
REMARQUE : Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir leur décubitus sternal.

Résultats

Figure 1 : Présentation photographique de la procédure d’inoculation IN à l’aide du dispositif de positionnement. (A) Équipement expérimental requis pour l’inoculation de l’IN. (B) Animaux en position tête baissée et avancée assis sur ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souche
Balb/c	Orient Bio	N/A	6-8 semaines, 20-30g
Peptides
RVG9R	Peptron	N/A	YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSR GKRASNGGGGRRRRRRRRR
RVM9R	Peptron	N/A	MNLLRKIVKNRRDEDTQKSS PASAPLDGGGGRRRRRRRRR
Logiciels, algorithmes et dispositifs
Dispositif de positionnement de la souris	Signet Biotech	N/A
Oligonucléotides et amorces
siSOD1	ST Pharm	N/A	Sense : 5'- GGUGGAAAUGAAGAAAGUA-3'SOD1
amorces	ST Pharm	N/A	F : 5'-CCAGTGCAGGACCTCTCATTTT-3' R : 5'-CACCTTTGCCCAAGTCATCT-3'

de souris