Analyse de la morphologie dendritique à travers les couches et les colonnes de la drosophile

Résumé

Source : Ting, C., et al., Analyse de la morphologie dendritique en colonnes et en couches. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre la procédure de préparation d’un cerveau de drosophile, de capture d’empilements d’images horizontales et frontales de dendrites médullaires marquées à la GFP sous un microscope confocal, et de création d’une reconstruction 3D pour analyser leur morphologie à travers les couches et les colonnes.

Protocole

1. Acquisition d’images doubles

REMARQUE : Cette étape est conçue pour acquérir deux piles d’images du neurone d’intérêt dans deux orientations orthogonales (horizontale et frontale).

1. Préparez des cerveaux de mouches contenant des neurones rachideux peu marqués (~10 cellules/lobe cérébral) avec un marqueur de protéine fluorescente verte membranaire (GFP) (mCD8GFP). Colorez le cerveau avec de l’anti-GFP de lapin (pour les dendrites des neurones de la moelle) et du mAb24B10 de souris (pour les axones photorécepteurs), des anticorps primaires et des anticorps secondaires fluorescents (anticorps anti-lapin Alexa 488 et anticorps anti-souris A....

Résultats

Figure 1. Préparation d’échantillons pour l’imagerie à double vue et la symétrie du réseau de colonnes médullaires de la drosophile. (A, B) Montage d’échantillons pour l’imagerie à double vu.......

Matériaux

http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Software
Huygens Professional	Scientific Volume Imaging	version 16.05	Pour la déconvolution d’image (https://svi.nl). logiciel commercial
MIPAV		version 7.3.0	Pour la recombinaison et l’enregistrement d’images (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware
MIPAV plugin : PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class			Freeware
MIPAV plugin : PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class			Freeware
Imaris	Bitplane		Pour le traçage des neurites et l’attribution de points de référence pour l’alignement d’images (http://www.bitplane.com). logiciel commercial
Vaa3D			Pour la visualisation de fichiers swc (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware
Matlab	Mathworks	R2014b	Pour l’analyse morphométrique des dendrites (http://www.mathworks.com). logiciel commercial
Matlab toolbox : TREES1.14		v1.14	Pour l’analyse des paramètres morphométriques dendritiques ( http://www.treestoolbox.org/download.html). boîte
à outils Matlab gratuite : Dendritic_Tree_Toolbox		v1.0	Pour le calcul des paramètres morphométriques (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Logiciel gratuit
Fichiers
		de	fichier SWC
Les codes et les fichiers d’exemple pour la combinaison et l’enregistrement		des images	https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration
Exemple			de point de référencehttps://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2
Système
MS Windows Windows 7 x64 ou Macintosh OS X 10.7 ou version ultérieure			Processeur quad-core 3 GHz 64 bits, 16 Go de RAM (minimale)
En option : Quadro4000 (ou supérieur) Carte graphique	Nvidia		Pour la visualisation stéréographique des dendrites.
En option : NVIDIA 3D vision2	Nvidia		http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html
En option : Écran LCD 120 Hz pour NVIDIA 3D vision2			http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html
Réactifs pour l’imagerie de l’anticorps
24B10	The Developmental Studies Hybridoma Bank	24B10
GFP Tag Anticorps	Thermofisher Scientific	G10362
Anti-Lapin (H+L), Alexa Fluor 488	Thermofisher Scientific	A11034
Anti-Souris Chèvre (H+L), Alexa Fluor 568	Thermofisher Scientific	A21124
VECTASHIELD Antifade Montage Medium	Vector Laboratories	H-1000
Montage Clay	Fisher	S04179
70 % de glycérol dans 1X PBS
Verres de couverture, haute performance, D=0.17mm	Zeiss	474030-9000-000

d’exemple Définition informatique