Imagerie de la libération de neurotransmetteurs à l’aide de rapporteurs fluorescents de neurotransmetteurs à base de cellules

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation CNiFER dans le cortex de

1. la souris Stérilisez tous les outils chirurgicaux dans un autoclave avant la chirurgie. Préparez un champ semi-stérile pour la chirurgie en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 % et en posant une couche de laboratoire propre.
2. Préparez la pipette d’injection CNiFER en tirant un capillaire en verre (diamètre intérieur de 0,53 mm) sur un extracteur d’électrode vertical. À l’aide d’une paire de pinces à pointe fine n° 5, cassez la pointe de l’électrode pour lui donner un diamètre de ~40 μm.
   Remarque : Il est préférable de le faire avec un microscope stéréo à zoom avec un réticule.
3. Anesthésie une souris adulte (postnatal 60-90) C57BL/6 avec de l’isoflurane : 4 % (v/v) pour l’induction et 1,5 à 2,0 % (v/v) pour l’entretien. Utilisez un pincement de la queue ou des orteils pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée.
   Remarque : Pincez à nouveau périodiquement et évaluez les contractions des moustaches tout au long de l’opération pour réévaluer la profondeur de l’anesthésie.
4. Couvrez les yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement. Montez la souris dans un cadre stéréotaxique avec des barres d’oreille. Maintenez la température du corps de la souris à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant régulé par une sonde rectale.
5. Rasez une zone d’environ 5 mm sur 12 mm avec un rasoir électrique pour animaux. Appliquez de la bétadine suivie de 70 % (v/v) d’isopropanol. Utilisez une lame de scalpel pour couper et retirer la peau sur la surface du crâne. À l’aide d’une lame de scalpel, vous pouvez retirer le périoste de la surface du crâne. Exposez et nettoyez la surface du crâne, comme décrit pour la chirurgie stéréotaxique.
6. Abaissez une pipette de verre vide jusqu’au bregma et notez les coordonnées antéro-postérieure (A/P) et médio-latérale (M/L). En se référant à l’atlas du cerveau de la souris, calculez la position du site d’injection. Déplacez la pipette vers le site cible et marquez le crâne pour la formation ultérieure de la fenêtre.
   Remarque : Le site d’injection et la fenêtre dépendent de la région à étudier et de la distribution des projections libérant des neurotransmetteurs ou des peptides dans le cortex. Par exemple, dans une publication récente, les coordonnées stéréotaxiques +1,0 à +2,0 mm A/P et +1,0 à +2,0 mm M/L ont été utilisées pour injecter des cellules CNiFER dans le cortex frontal pour l’imagerie in vivo de la libération de dopamine pendant le conditionnement classique.
7. Former une fenêtre crâne amincie de 2 mm x 3 mm.
   Remarque : L’os de la fenêtre doit avoir une épaisseur de 15 à 20 μm. Les petites taches blanches dans l’os ne doivent pas être visibles lorsque la surface du crâne est humidifiée, si l’os est suffisamment aminci.
8. Placez une éponge imbibée de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) sur la fenêtre pour la garder humide tout en préparant les cellules à injecter.
9. Récoltez le clone CNiFER qui a été cultivé dans une fiole T75 à ~80 % de confluence. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Remarque : La trypsine est omise pour ces étapes.
10. Retirez le PBS et utilisez 10 ml d’ACSF pour déloger les cellules du fond du ballon. Triturer les cellules pour dissocier les amas cellulaires. Centrifuger et remettre en suspension la pastille dans 100 μl d’ACSF. Centrifugez pendant 30 secondes à 1 400 x g et retirez le surnageant, en laissant une pastille recouverte d’ACSF. Cette étape laisse un amas de cellules en suspension.
11. Remplissez la pipette d’injection préparée à l’étape 1.2 avec de l’huile minérale, chargez la pipette sur un nano-injecteur et avancez le piston pour éjecter un petit cordon d’huile. Mettre 5 μl de suspension cellulaire CNiFER sur une bande de film de paraffine plastique près de la préparation de souris. Aspirez les CNiFER ou les cellules CNiFER de contrôle dans la pipette tirée.
12. Déplacez la pipette jusqu’aux coordonnées X et Y cibles, c’est-à-dire A/P et M/L indiquées à l’étape 1.5. Abaissez la pipette, perçant le crâne aminci, et continuez jusqu’à ~200-400 μm sous la surface du crâne, pour déposer les cellules CNiFER dans les couches 2/3 du cortex.
13. Injectez ~4,6 nl de cellules CNiFER au site le plus profond avec le nanoinjecteur, notez le mouvement dans l’interface huile-cellule, puis attendez 5 min pour que les cellules se distribuent. Retirer la pipette ~100 μm et injecter encore ~4,6 nl de cellules CNiFER, attendre 5 min. Retirez ensuite la pipette lentement et doucement pour éviter le reflux des CNiFERs. Injections répétées à un ou plusieurs sites adjacents.
14. Répéter les étapes d’injection 1.8 à 1.12 avec des cellules de contrôle HEK293 (c’est-à-dire un clone HEK293/TN-XXL/Gqi5 dépourvu de récepteur couplé aux protéines G [RCPG]). Séparez les sites d’injection du CNiFER et de la cellule témoin de ~200 μm.
15. Une fois les implantations cellulaires terminées, rincez la fenêtre du crâne amincie avec de l’ACSF et attendez que le crâne sèche. Appliquez une goutte de colle cyanoacrylate (voir Matériaux) sur la fenêtre et placez rapidement un verre de couverture stérile prédécoupé sur la colle. Poussez doucement le verre de protection contre le crâne pendant quelques secondes. Laissez sécher la colle pendant 2 min.
16. Scellez les bords de la vitre de protection avec du ciment dentaire et formez un puits autour de la fenêtre pour retenir l’eau pour l’objectif de trempage.
17. Pour immobiliser la tête de la souris pendant l’imagerie, fixez une barre de tête sur mesure avec une petite goutte de colle cyanoacrylate derrière la fenêtre. Laissez la colle sécher complètement, puis ajoutez du ciment dentaire supplémentaire pour renforcer davantage la barre de tête sur mesure.
18. Couvrez le reste de la surface du crâne, à l’exception de la fenêtre, avec une couche de ciment dentaire. Assurez-vous que les bords de la peau sont recouverts de ciment et laissez-la sécher pendant 20 min.
19. Après l’opération, arrêtez l’administration d’isoflurane et laissez la souris sur un coussin chauffant dans une cage jusqu’à ce qu’elle se remette complètement de l’anesthésie. Injecter 5 % (p/v) de glucose dans une solution saline (sous-cutanée [s.c.]) pour la réhydratation et 0,05 à 0,1 mg/kg de buprénorphine (intrapéritonéale [i.p.], libération instantanée) pour l’analgésie postopératoire.
    Remarque : Pour minimiser la réaction immunologique potentielle aux CNiFER humains, injecter quotidiennement à la souris 20 μl/100 g de cyclosporine (i.p.) en commençant la veille de l’injection des CNiFERs.
20. Remettez la souris dans sa cage d’origine pour la nourriture et l’eau.

2. Imagerie in vivo des clones de CNiFER

Remarque : L’imagerie en direct est réalisée avec des souris à l’aide d’un microscope à deux photons et d’un appareil fixé par la tête. Aucune anesthésie n’est nécessaire lors des séances d’imagerie. Lorsque vous imagez des animaux à l’état d’éveil, limitez l’appuie-tête à quelques heures à la fois pour réduire les niveaux de stress. Remettez l’animal dans sa cage d’accueil entre les séances d’imagerie pour la nourriture et l’eau. Le stress potentiel est minimisé en assombrissant les lumières de la pièce et en entourant la partie de la souris dans un enclos.

1. Le lendemain de l’intervention, montez la souris sur une plateforme d’imagerie en vissant la barre de tête métallique implantée sur le crâne sur le cadre de fixation de la tête.
   Remarque : Lors de l’imagerie de souris éveillées, la séance d’imagerie ne doit pas dépasser quelques heures en raison du stress potentiel induit par le dispositif d’appuie-tête.
2. Placez la plate-forme d’imagerie avec la souris à tête immobilisée dans un microscope d’imagerie à deux photons équipé d’objectifs d’immersion dans l’eau 10X (0,30 NA) et 40X (0,80 NA).
3. Insérez un cube filtrant pour l’imagerie par transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) (protéine fluorescente cyan améliorée [eCFP] et citrine) doté d’un miroir dichroïque à 505 nm et de filtres passe-bande qui s’étendent de 460 nm à 500 nm pour mesurer l’eCFP et de 520 nm à 560 nm pour mesurer la citrine.
4. Ajoutez l’ACSF dans la fenêtre du crâne aminci du puits et abaissez l’objectif d’immersion dans l’eau dans l’ACSF. Utilisez l’oculaire en conjonction avec une lampe à mercure et un cube de filtre à protéine fluorescente verte (GFP) pour localiser la surface du cortex et du système vasculaire sous la fenêtre.
   Remarque : Le motif du système vasculaire permet de localiser et d’imager la même région au cours de plusieurs jours d’imagerie. Passez à l’objectif d’immersion dans l’eau 40X pour localiser les CNiFER en faisant la mise au point manuellement sur la surface du cortex au-dessus des cellules à l’aide du cube de filtre GFP et d’une lampe à mercure.
5. Configuration pour l’imagerie à deux photons. Sélectionnez le trajet lumineux approprié pour l’imagerie à deux photons. Pour un système commercial typique, utilisez le logiciel pour passer en mode d’imagerie à deux photons et rediriger la lumière vers les tubes photomultiplicateurs (PMT) dans les détecteurs non désançonnés. Allumez le laser pulsé femtoseconde dans le proche infrarouge, sélectionnez une longueur d’onde de 820 nm et un réglage de puissance de 5 à 15 %.
   Remarque : Une puissance de 5 % fournit généralement ~25 mW sur l’échantillon.
6. Réglez la tension PMT1 et PMT2 à un niveau proche de la valeur maximale, généralement de 700 à 1 000 V selon le PMT. Réglez le gain sur 1 pour chaque voie et sur zéro la position z pour l’objectif.
7. Abaissez l’objectif à ~100 à 200 μm de la surface corticale et démarrez le balayage x-y. Ajustez la puissance laser, le gain et la tension PMT pour chaque voie, c’est-à-dire eCFP et Citrine, afin d’optimiser le rapport signal/bruit de la fluorescence CNiFER.
8. Utilisez la fonction de zoom du logiciel pour restreindre l’image à une région contenant les cellules CNiFER ainsi qu’une région d’arrière-plan. Utilisez une vitesse de balayage ne dépassant pas une image toutes les 2 secondes (0,5 Hz) à 4 μs par pixel. Ajustez la moyenne de ligne pour obtenir un rapport signal/bruit approprié, par exemple, la moyenne de Kalman sur 2 lignes.
9. Dessinez une région d’intérêt (ROI) autour des cellules CNiFER, autour d’environ 3 à 4 cellules par plan. Mettez en place une analyse en temps réel des intensités moyennes du ROI. Démarrez l’acquisition pour surveiller la fluorescence de CNiFER au fil du temps.
10. Recueillir la fluorescence des CNiFER avant et pendant les manipulations expérimentales, par exemple, la stimulation électrique, la stimulation de la Channelrhodopsine-2 (ChR2), le comportement, tel que déterminé par l’utilisateur.
11. Une fois l’expérience d’imagerie terminée, remettez la souris dans sa cage d’origine. Répétez l’imagerie sur plusieurs jours, si vous le souhaitez. Lors de la réimagerie, les cellules se réfèrent à l’image vasculaire à faible grossissement précédemment acquise pour s’orienter vers le même champ d’imagerie (étape 2.4).
    Remarque : Les CNiFER implantés peuvent être imagés pendant au moins 7 jours.