Imagerie de la libération de neurotransmetteurs à l’aide de rapporteurs fluorescents de neurotransmetteurs à base de cellules

Résumé

Source : Lacin, E., et al. Construction de neurotransmetteurs fluorescents à base de cellules (CNiFERs) pour la détection optique de neurotransmetteurs in vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une technique d’imagerie de la libération de neurotransmetteurs in vivo à l’aide de neurotransmetteurs à base de cellules CNiFERs, des cellules rapporteures spécialisées pré-injectées dans le cortex de la souris. Positionnée sous un microscope à deux photons, la souris permet de visualiser la signalisation calcique induite par les neurotransmetteurs par émission de fluorescence. La méthode exploite la liaison des neurotransmetteurs aux récepteurs couplés aux protéines G sur les CNiFERs, déclenchant la libération de calcium et la fluorescence pour détecter l’activité des neurotransmetteurs en temps réel.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Implantation CNiFER dans le cortex de

1. la souris Stérilisez tous les outils chirurgicaux dans un autoclave avant la chirurgie. Préparez un champ semi-stérile pour la chirurgie en l’essuyant avec de l’éthanol à 70 % et en posant une couche de laboratoire propre.
2. Préparez la pipette d’injection CNiFER en tirant un capillaire en verre (diamètre intérieur de 0,53 mm) sur un extracteur d’électrode vertical. À l’aide d’une paire de pinces à pointe fine n° 5, cassez la pointe de l’él....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
colle cyanoacrylate	Loctite Loctite	no. 495	chirurgie et injection stéréotaxique
film de paraffine plastique	VWR	Parafilm®	injection stéréotaxique
NANOINJECTOR	Drummond	3-000-204	chirurgie et injection stéréotaxique
ÉLECTRODES DE VERRE	Drummond	3-000-203G	Chirurgie et injection stéréotaxique
Foret à main	OSADA	Exl-M40	Chirurgie et injection stéréotaxique
Meules pour foret	Fine Scientific	19007-05 ; 19007-07)	chirurgie et injection stéréotaxique
Bain de stérilisation	FST	18000-45, Hot Bead	Stérilisateur chirurgie et injection stéréotaxique
chambre/masque isoflurane	Highland Medical Equipment	564-0427, HME 109 Machine d’anesthésie de table avec vaporisateur d’isoflurane, débitmètre O2, vanne gang ; 564-0852, Chambre d’induction 16X7X7.5cm	chirurgie et injection stéréotaxique
Lunette 3D avec bras	Chirurgie Zeiss		et injection stéréotaxique
lumière		à fibre optique	chirurgie et injection stéréotaxique Chirurgie
de la bétadine			et injection stéréotaxique
70 % (v/v) Alcool			chirurgie et injection stéréotaxique
Povidone-Iode Prep Pads	dynarex	1108	chirurgie et injection stéréotaxique
NaCl 0,9 % (INJECTION, USP, 918610)			chirurgie et injection stéréotaxique
CYCLOSPORINE (INJECTION, USP)			chirurgie et injection stéréotaxique
Buprenex (INJECTION) buprénorphine (0,03 μg par g de rongeur)	Sigma		chirurgie et injection stéréotaxique
Pommade ophtalmique	Akorn	NDC 17478-235-35	chirurgie et injection stéréotaxique
Surgifoam	Ethicon		chirurgie et injection stéréotaxique
Grip ciment dentaire	Dentsply	#675571,	chirurgie 675572 et injection stéréotaxique
Instant SuperGlue	NDindustries		chirurgie et injection stéréotaxique
LOCTITE 4041			chirurgie et injection stéréotaxique
METABOND	C&B		chirurgie et injection stéréotaxique
n° 0 verre			chirurgie et injection stéréotaxique
cadre stéréotaxique Chirurgie	Kopf		et injection stéréotaxique
Sonde rectale et coussin chauffant	FHC	40-90-8D, Régulateur de température DC, 40-90-2-06, Coussin chauffant 6.5X9.5cm40-90-5D-02, Chirurgie de la sonde de thermistance rectale	et injection optique stéréotaxique
plaque d’essai pour l’imagerie	Thorlabs		chirurgie et injection stéréotaxique
Huile minérale	Fisher	S55667	chirurgie et injection stéréotaxique
Kwik-Cast (élastomère de silicone)	World Precision Instruments		chirurgie et injection stéréotaxique
Suture	Ethicon	18'', 1667, chirurgie 4-0	et injection
Ciseaux	Outils Scientifiques Fins	91500-09, 15018-10	Chirurgie et injection stéréotaxique
Forcepts	Outils Scientifiques Fins	11252-30 ; #55, 11295-51 ; Grafe, 11050-10	chirurgie et injection stéréotaxique
Student Halsted-Mosquito Hemostats	Fine Scientific Tools	91308-12	chirurgie et injection stéréotaxique
Kit de cautérisation des petits vaisseaux	Outils scientifiques fins	18000-00	chirurgie et injection stéréotaxique
Stérilisateurs à billes chaudes	Outils scientifiques fins	18000-45	chirurgie et injection
stéréotaxiqueBoîtier d’instrument avec tapis en silicone	Fine Scientific Tools	20311-21	chirurgie et injection stéréotaxique
Conteneurs de stérilisation en plastique avec tapis en silicone	Outils scientifiques fins	20810-01	chirurgie et injection stéréotaxique
Lunette de fluorescence à étape fixe 2P pour l’imagerie in vivo	Olympus	FV1200 MPE	Imagerie in vivo
Laser multiphotonique	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	Imagerie in vivo
Laser vert	Olympus	473 nm	Imagerie laser in vivo
xy base de traduction	Scientifica	MMBP	Imagerie in vivo
Cube de filtre FRET pour YFP et CFP	Imagerie in vivo Olympus
immersion dans l’eau 25-X	Olympus		Imagerie in vivo
table d’air	Newport		Imagerie in vivo
Cage étanche à la lumière sur mesure	Thorlab		Imagerie in vivo

et isopropylique de couverture Fisher stéréotaxique Objectif à