Isolement et purification de glycoprotéines d’oligodendrocytes de myéline recombinante

Résumé

Source : Jain, R. W., et al. Production et purification simples et efficaces de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline de souris pour des études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre l’isolement et la purification de MOGtag, une glycoprotéine oligodendrocytaire (MOG) de myéline recombinante utilisée dans les études expérimentales sur l’encéphalomyélite auto-immune (EAE). Le protocole implique la lyse bactérienne, la sonication, la centrifugation et la chromatographie d’affinité avec le nickel pour obtenir un MOGtag purifié. Cette protéine permet la recherche sur l’auto-immunité médiée par les lymphocytes B dans des modèles de sclérose en plaques.

Protocole

1. Aéroport Récolte de la protéine MOGtag

REMARQUE : À ce stade, la bactérie aura produit de grandes quantités de protéines MOGtag. Pour récolter le MOGtag, les bactéries sont d’abord lysées dans un tampon Triton X-100, puis sonications. MOGtag est ensuite libéré des corps d’inclusion et dénaturé avec de l’imidazole et de la guanidine, ce qui donne une solution protéique brute contenant la protéine MOGtag.

1. Prélever une aliquote de 1 ml de l’une des cultures de nuit et la transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Granulez les cellules à 16 000 x g pendant 1 min et retirez le surnageant. Étiquetez le tube TO/N (post-induction), puis placez la pastille bactérienne dans un congélateur à -20 °C pour une analyse ultérieure de la page de la FDS (Figure 2).
2. Répartissez uniformément les cultures dans des flacons de 250 ml compatibles avec la centrifugation à grande vitesse et conservez-les sur de la glace à partir de ce moment. Granulez les cellules bactériennes à 22 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
3. Jetez le surnageant. Stockez les granulés bactériens à -20 °C ou passez à l’étape 1.4.
4. Préparez un tampon de lyse (0,1 mg/ml de lysozyme d’œuf de poule, 0,1 % de Triton-X (v/v) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) en ajoutant 60 μl de Triton X-100 et 120 μl de 50 mg/ml de solution mère de lysozyme d’œuf de poule à 60 mL de PBS.
5. Remettez en suspension et combinez toutes les pastilles bactériennes de l’étape 1.3 dans un total de 30 ml de tampon de lyse. Transférez ce volume dans un tube à fond rond de 50 ml capable d’une centrifugation à grande vitesse. Placez ce tube dans un bain-marie à 30 °C pendant 30 min. Pendant le temps d’incubation, secouez deux fois le tube pour remettre les cellules en suspension.
6. Après l’incubation, transférez le tube sur la glace et sonisez la solution à 20 kHz, amplitude 70 %, impulsion pendant 3 secondes, impulsion désactivée pendant 3 secondes et cinq impulsions par tour. Sonicez la solution pendant six tours au total et laissez la solution refroidir sur la glace entre les tours.
7. Centrifuger la solution à 24 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jeter le surnageant et répéter les étapes 1,5 à 1,7 une fois. Stockez le granulé à -20 °C ou passez à l’étape 1.8.
8. Préparez le tampon A (500 mM de NaCl (chlorure de sodium), 20 mM de Tris-HCl (chlorhydrate de Tris (hydroxyméthyl)aminométhane), 5 mM d’imidazole, pH 7,9) en ajoutant 0,8766 g de NaCl, 0,09456 g de Tris-HCl et 0,01021 g d’imidazole dans un bécher de 100 ml. Ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 28 ml, puis ajustez le pH de la solution à 7,9. Ensuite, transférez la solution dans un cylindre gradué de 100 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume soit de 30 ml.
9. Remettre la pastille en suspension à partir de l’étape 1.7 dans 30 ml de tampon A et incuber cette solution à 4 °C pendant 3 heures. Pendant ce temps, pesez 17,2 g de guanidine-HCl.
10. Soniquez la solution sur de la glace en utilisant les mêmes paramètres qu’à l’étape 1.6. Ajoutez ensuite 17,2 g de guanidine-HCl à la solution. Incuber sur de la glace pendant 1 heure pour solubiliser la protéine MOGtag.
11. Centrifuger la solution à 24 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Recueillir le surnageant et le stocker à 4 °C jusqu’à la purification des protéines.

2. Purification des protéines

REMARQUE : Dans les étapes suivantes, la protéine MOGtag sera purifiée par 4 cycles d’absorption sur de la résine de nickel chargée (via le His-tag) et élution.

1. Préparez les tampons suivants :
   1. Préparez le tampon B (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 5 mM d’imidazole, 6 M de guanidine-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 0,0681 g d’imidazole et 114,64 g de guanidine-HCl dans un bécher de 500 ml. Ajoutez ensuite de l’eau jusqu’à ce qu’elle atteigne 190 ml et ajustez le pH à 7,9. Transférez la solution dans un cylindre gradué de 250 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 200 ml.
   2. Préparez le tampon d’élution (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 0,5 M d’imidazole, 6 M de guanidine-HCl, pH 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 6,808 g d’imidazole et 114,64 g de guanidine-HCl dans un bécher de 500 ml. Ajoutez de l’eau jusqu’à ce qu’il atteigne 190 ml et ajustez le pH à 7,9. Transférez la solution dans un cylindre gradué de 250 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 200 ml.
   3. Préparez un tampon en bandelettes (500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, 100 mM d’EDTA (acide éthylène-diaminetétraacétique), pH de 7,9). Ajouter 5,844 g de NaCl, 0,6304 g de Tris-HCl, 40 ml de 500 mM d’EDTA dans un bécher de 500 mL. Ajouter de l’eau jusqu’à ce qu’il atteigne 190 ml et ajuster le pH à 7,9. Transférez la solution dans un cylindre gradué de 250 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 200 ml.
   4. Préparez le tampon de charge (0,1 M de sulfate de nickel). Ajoutez 5,257 g de sulfate de nickel dans un bécher de 500 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce qu’elle atteigne 190 ml (ATTENTION, ne manipulez pas le sulfate de nickel à l’extérieur d’une hotte tant que le sulfate de nickel n’a pas été dissous dans l’eau). Une fois le sulfate de nickel dissous, transférez la solution dans un cylindre gradué de 250 ml et ajoutez de l’eau jusqu’à ce que le volume atteigne 200 ml.
2. Répartissez 10 ml de résine de nickel entre deux tubes de centrifugation coniques de 50 ml capables de résister à des forces centrifuges supérieures à 4 500 x g (5 ml dans chaque tube).
3. Chargez et équilibrez la résine de nickel :
   1. Lavez la résine en ajoutant 40 ml d’eau dans chaque tube contenant la résine. Posez les tubes horizontalement sur une bascule et laissez-les agiter pendant 5 min à 4 °C. Une fois terminé, centrifugez les tubes à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C.
   2. Jetez le surnageant par pipetage pour éviter de déranger la pastille. Ajoutez 40 ml de tampon de charge dans chaque tube. Transférez les tubes sur une bascule et laissez-les agiter pendant 15 min à 4 °C. Une fois terminé, centrifugez les tubes à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C.
   3. Jetez le surnageant, puis ajoutez 40 ml de tampon B dans les tubes. Transférez les tubes sur une bascule et laissez-les agiter pendant 5 min à 4 °C. Une fois terminé, centrifugez les tubes à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C, puis jetez les surnageants.
4. Facultatif : Prélever 150 μl de la protéine solubilisée recueillie à l’étape 1.11 et la transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Étiquetez le tube comme étant en pré-incubation et congelez-le à -20 °C pour une future analyse de la page SDS (dodécylsulfate de sodium) (Figure 2, MOGtag brut).
5. Purifiez le MOGtag Protein :
   1. Transférez tout le volume de protéine solubilisée de l’étape 1.11 (~40 ml, moins le petit échantillon prélevé à l’étape 2.4) dans le premier tube (Figure 1, tube 1) contenant de la résine de nickel de l’étape 2.3, mélangez et placez horizontalement sur une bascule à 4 °C pendant 1 heure.
   2. Centrifuger le tube à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C. Une fois terminé, transférez le surnageant dans le deuxième tube (Figure 1, tube 2) de résine de nickel et incubez comme décrit à l’étape précédente. Pendant ce temps, continuez avec les étapes 3 à 6 ci-dessous avec le tube 1.
   3. Remettre la résine de nickel en suspension dans un tube de 1 à 40 ml de tampon d’élution et placer le tube horizontalement sur une bascule à 4 °C pendant 5 min. Ensuite, centrifugez le tube à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C.
   4. Transvasez le surnageant contenant la protéine MOGtag éluée dans un flacon de 250 ml portant la mention « protéine MOGtag purifiée » et maintenez ce flacon à 4 °C. À chaque étape d’élution, regroupez le surnageant résultant dans cette bouteille.
   5. Ajoutez 40 ml de tampon à bande à la résine de nickel et placez-le horizontalement sur une bascule pendant 5 min à 4 °C.
   6. Centrifugez le tube à 4 500 x g pendant 8 min à 4 °C. Jetez le surnageant, puis rechargez la résine de nickel comme indiqué à l’étape 2.3.
   7. Une fois terminé, avancez avec le deuxième tube comme indiqué à l’étape 2.5. Un total de 4 cycles d’absorption de la protéine solubilisée à partir de l’étape 1.11 sur la résine de nickel chargée et l’élution permettra de récupérer la majeure partie de la protéine, bien que, si on le souhaite, des protéines supplémentaires puissent être récupérées lors de cycles supplémentaires d’absorption et d’élution.
6. Une fois que quatre cycles (ou plus) d’absorption et d’élution sont terminés, stockez la protéine purifiée à 4 °C pendant la nuit. La résine de nickel peut être stockée dans 40 ml d’une solution d’éthanol à 20 % à 4 °C jusqu’à ce qu’elle soit à nouveau nécessaire.

Résultats

Figure 1 : Vue d’ensemble des étapes nécessaires à la production de protéines MOGtag pures. Pour générer la protéine MOGtag, les bactéries exprimant la protéine MOGtag sont cultivées à des densités élevées, puis ind...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BL21 E.coli- pet32-MOGtag	Kerfoot lab		Ces bactéries sont nécessaires à la fabrication de la protéine MOGtag. Des stocks de glycérol de ces bactéries sont disponibles sur demande.
LB bouillon meunier	Bioshop	LBL407.1
Ampicilline	Bio basic	AB0028	Reconsitituter la poudre en 50 % d’éthanol/ 50 % H₂O à 100 mg/ml. Conserver à -20 °C.
IPTG	Bioshop	IPT002.5	Reconsitituter la poudre en H₂O à 1M et stocker à -20 °C.
Lysozyme poule-œuf	Bioshop	LYS702.10	Reconstituer en H₂O à 50 mg/ml et conserver à -80 °C.
Triton-X100	Sigma	T-8532
Saline tamponnée au phosphate	technologies	20012-027	La solution saline tamponnée au phosphate commerciale n’est pas nécessaire, toute solution saline tamponnée au phosphate standard fabriquée en laboratoire est suffisante.
Chlorure de sodium		Bioshop SOD004.1
Tris-HCl	Bioshop	TRS002.1
Imidazole	Bioshop	IMD508.100
Guanidine-HCl	Sigma	G3272	La qualité doit être supérieure à 98 % de pureté.
0.5M EDTA	bioshop	EDT111.500
Sulfate de nickel (II)	Bioshop	NIC700.500
His binding resine	EMD Millipore	69670-3	Conserver dans 20 % d’éthanol 80 % H₂O à 4 °C
Éthanol anhydre	Alcools commerciaux	P016EAAN	Diluer avec de l’eau au besoin.
Acide acétique glacial	Bioshop	ACE222.1
Acétate de sodium trihydraté	Bioshop	SAA305.500
Albumine sérique bovine standard	bio-rad	500-0206
Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique dihydraté	Fisher scientific	BP120-500
Polyéthylèneglycol 3350	Bioshop	PEG335.1
polyéthylèneglycol 8000	Bioshop	PEG800.1
Sonicateur	Fisher scientific	FB-120-110
Dodécylsulfate de sodium	Bioshop	SDS001

Life