Injection d’un vecteur viral dans la moelle épinière d’un rat pour le traçage neuronal rétrograde

Résumé

Source : Keefe, K. M., et al. L’injection directe d’un vecteur lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices dans la moelle épinière du rat. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo démontre l’injection d’un vecteur viral de transport rétrograde à haut rendement (HiRet) dans la moelle épinière du rat pour tracer les voies neuronales. Le virus possède des glycoprotéines pour l’entrée synaptique et un gène codant pour une protéine fluorescente. L’aiguille est insérée dans la moelle épinière et la suspension du virus est administrée à un rythme contrôlé. L’aiguille est finalement retirée après avoir laissé suffisamment de temps pour la diffusion virale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparations pré-chirurgicales

1. Préparez des aiguilles de verre tirées pour l’injection virale quelques jours avant l’intervention chirurgicale à l’aide de pipettes capillaires en verre de 3,5 nanolitres conçues pour les injecteurs de nanolitres. Tirez chaque pipette sur un extracteur d’aiguille en deux étapes selon les instructions du fabricant pour créer des gabarits à deux aiguilles.
2. Affinez la pointe de l’aiguille en coupant environ 1 à 2 mm de verre en excès avec des microciseaux. Mesurez la taille approximative de l’ouverture au microscope à l’aide d’une lame d’étalonnage de microscope pour isoler les aiguilles avec des ouvertures de 30 à 40 μm.
3. Avec l’aiguille positionnée à 30°, utilisez une micropipette biseautée pour créer une pointe avec une ouverture de 30-40 μm et un angle biseauté de 45°. Vérifiez la largeur de l’ouverture à l’aide de l’échelle de Vernier sur la diapositive d’étalonnage. Faites passer de l’eau et de l’éthanol à travers l’aiguille en verre à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille flexible pour éliminer les débris et marquez l’aiguille à intervalles réguliers avec un marqueur noir.
4. Placez les aiguilles dans une boîte de Pétri couverte préalablement nettoyée avec de l’éthanol à 70 % et stérilisez pendant 30 minutes dans une cagoule de biosécurité sous lumière ultraviolette ou UV.
5. Préparez le lentivirus de transport rétrograde très efficace (HiRet) en retirant un volume approprié du congélateur immédiatement avant l’intervention.
   REMARQUE : Un volume approprié comprend la quantité nécessaire pour l’injection (1 μL par injection x nombre d’injections) plus une petite quantité de volume supplémentaire pour tenir compte des pertes de pipetage et de chargement. Transportez et stockez le virus sur de la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
6. Préparez l’injecteur en le branchant sur la micropompe et en le plaçant dans un micromanipulateur doté d’une échelle de Vernier.
7. Pour préparer l’aiguille de verre, chargez soigneusement un colorant coloré tel que de l’huile rouge avec une seringue équipée d’une aiguille flexible. Assurez-vous qu’il ne reste pas de bulles dans l’aiguille. Utilisez une technique aseptique lors de la manipulation de l’aiguille et évitez de toucher la pointe.
8. Insérez l’aiguille en verre dans l’injecteur, en vous assurant que l’aiguille est correctement insérée dans les rondelles, que le capuchon de l’injecteur est bien vissé et que l’aiguille de l’injecteur en acier est rallongée d’environ 3/4 de la longueur de l’aiguille en verre. Les virus peuvent être chargés dans l’aiguille lors d’une étape ultérieure.

2. Anesthésie et préparation du site chirurgical

1. Pesez l’animal sur une balance numérique. Enregistrer le poids préopératoire pour déterminer le volume d’anesthésique nécessaire et permettre le suivi du poids après la chirurgie. Des rats femelles Sprague-Dawley, d’environ 200 à 250 g, ont été utilisés dans ce protocole.
2. Anesthésier le rat à l’aide d’une inhalation d’isoflurane ou d’une solution injectée de kétamine/xylazine (k/x). Ici, la kétamine est injectée par voie intrapéritonéale à une dose de 67 mg/kg et la xylazine à une dose de 6,7 mg/kg.
3. Confirmez un plan anesthésique approprié en pinçant fermement le pied. En cas de sevrage réflexe, attendez quelques minutes supplémentaires avant de continuer.
   REMARQUE : Observez également les moustaches, les yeux et le rythme respiratoire pour détecter des signes de conscience. Si les moustaches se contractent, si l’œil cligne lorsqu’on le touche doucement ou si la respiration est rapide et superficielle, attendez que le plan anesthésique soit plus profond pour poursuivre le protocole. Surveillez également ces signes tout au long de la laminectomie et de la chirurgie d’injection. Si l’animal présente un plan anesthésique peu profond, administrez une dose de rappel de kétamine uniquement égale à la dose initiale de k/x.
4. Rasez le rat le long de la ligne médiane dorsale, des hanches à l’angle inférieur des omoplates. Tirez sur la peau de l’animal pour un rasage plus facile et plus précis.
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux.
6. Appliquez un antiseptique sur la zone rasée pour stériliser le site. Pour le premier gommage, trempez de la gaze stérile avec une solution iodée à 5 % et essuyez tous les cheveux et débris. Poursuivez avec un balayage unidirectionnel avec de la gaze stérile imbibée d’éthanol à 70 % afin qu’aucune zone ne soit touchée deux fois. Utilisez cette même technique avec une alternance d’iode et de gaze imbibée d’éthanol deux fois de plus.

3. Préparation du champ chirurgical et

1. des instruments Préparez un ensemble d’outils chirurgicaux autoclavés comprenant un scalpel, des rongeurs, une pince à dents de rat, des ciseaux à ressort, des hémostats, des pinces incurvées à pointe moyenne et des écarteurs ou des crochets lestés en déballant l’emballage stérile pour créer un champ stérile.
2. Ouvrez un paquet de gants chirurgicaux stériles et placez le bandage de gant stérile sur la table. Utilisez-le comme champ stérile supplémentaire pour les outils usagés afin d’éviter la contamination de l’emballage stérile.
3. Déposez une lame de scalpel #10 sur le champ stérile. Fixez la lame à un manche avec des hémostatiques. Placez une solution saline stérile, une suture catgut chromique 4.0 et des matériaux pour contrôler les saignements tels qu’un cautérisant, de la gaze stérile, des applicateurs stériles à embout de coton (pour les saignements musculaires), de la mousse de gel ou de la cire osseuse (pour les saignements osseux) dans un endroit accessible.
4. Récupérez l’animal et placez-le sur un chiffon stérile. Placez de la gaze sous la vessie pour recueillir l’urine. Soulevez la zone cible avec une serviette roulée sous l’abdomen. Si possible, placez un coussin chauffant chirurgical sous le chiffon stérile, en particulier pour les procédures plus longues.
   REMARQUE : La stérilité est importante pendant la chirurgie de survie. Gardez un flacon pulvérisateur d’éthanol à 70 % à portée de main pour maintenir la stérilité des mains gantées, et un stérilisateur à billes si la stérilité de l’instrument est compromise, ou entre des chirurgies individuelles.

4. Exposer la colonne vertébrale et identifier le site de laminectomie

1. Identifiez la zone où une incision cutanée sera pratiquée en appuyant doucement les doigts sur la dernière côte pour localiser la vertèbre Lumber ou L1. En utilisant cela comme point de repère, faites une incision cutanée de 3-4 cm avec un scalpel chirurgical #10 se terminant juste en dessous de L1 pour exposer le muscle. Maintenez la peau tendue en l’étalant doucement et en appuyant fermement avec la lame du scalpel pour assurer une incision nette.
2. Coupez et étalez la graisse superficielle à l’aide de pinces et de ciseaux si nécessaire. (Selon la vertèbre cible, il peut y avoir ou non un gros coussinet adipeux superficiel au muscle.)
3. Sentez les apophyses épineuses avec le plat de la lame du scalpel ou un doigt. Souvent, la zone médiane sera délimitée par un « V » de fascia blanc de chaque côté. Faites une petite coupe rostrale pour laisser de la place pour s’agripper solidement à un processus supérieur avec une pince à dents de rat, puis faites deux coupes longues et profondes aussi près que possible des processus. Au point le plus profond de la coupe, la surface dorsale des vertèbres peut être ressentie avec la lame du scalpel.
4. Tenez les muscles latéraux de côté à l’aide d’écarteurs ou de crochets lestés pour améliorer la visibilité. Dégagez les muscles autour des processus avec un scalpel, des ciseaux à ressort ou des rongeurs pour déterminer la forme de leur tête.
   REMARQUE : N’oubliez pas que la moelle épinière ne s’étend pas sur toute la longueur de la colonne vertébrale, car le tissu de la moelle épinière cesse de se développer plus tôt dans le développement que l’os. Cela signifie que le niveau de la colonne vertébrale cible peut se trouver sous une vertèbre nommée différemment.
5. Localisez le thoracique ou T11 et les processus T12 et T13 adjacents.
   REMARQUE : On peut trouver de l’aide pour cibler les bons niveaux vertébraux dans un atlas de la moelle épinière de rat et des études antérieures décrivant des points de repère chez la souris, qui a une structure vertébrale très similaire6,33. Laissez une apophyse épineuse rostrale, telle que T9, intacte pour donner un point de repère sur la ligne médiane.

5. Réalisation d’une laminectomie

1. Une fois que la zone cible a été correctement identifiée, effectuez des laminectomies des aspects dorsaux de T11-T13. Écartez doucement les vertèbres pour révéler les ligaments intervertébraux, qui sont de bons sites pour insérer des rongeurs pour la morsure initiale de l’os. Tenez les rongeurs en position semi-fermée pour augmenter le contrôle fin.
2. Retirez les apophyses épineuses et la face dorsale des vertèbres en prenant de petites bouchées avec les rongeurs. Veillez à ne pas endommager la moelle épinière ou à ne pas déranger la dure-mère. Soulevez légèrement avec la pince à dents de rat pour aider à éloigner la moelle épinière des vertèbres et diminuer la tendance à frapper le tissu de la moelle épinière.
3. Dégagez l’os de la ligne médiane afin que le vaisseau sanguin de la ligne médiane puisse être observé. Laissez une fenêtre qui montre clairement le tissu de la moelle épinière et qui est exempte de débris.
4. Touchez doucement la moelle épinière avec une pince. Certains animaux peuvent sauter par réflexe même si leur plan anesthésique est profond. Appliquez quelques gouttes d’un agent anesthésiant, tel que la lidocaïne, directement sur la moelle épinière pour éviter de sauter pendant la procédure d’injection.
5. Fixez l’animal dans un support vertébral en fixant des pinces stabilisatrices aux apophyses épineuses, rostrales et caudales à la fenêtre de laminectomie. Soulevez l’abdomen de l’animal à l’aide du support de colonne vertébrale pour annuler l’effet des mouvements respiratoires. Cela augmentera la stabilité de l’aiguille et garantira la profondeur d’injection appropriée.

6. Chargement du virus et positionnement de l’injecteur

1. Chargez le virus dans l’injecteur en pipetant environ 5 μL sur un morceau de parafilm et en positionnant l’aiguille de manière à ce que l’embout soit à l’intérieur de la goutte.
2. Utilisez la micropompe pour prélever jusqu’à 4 μL de virus à un débit de 20 à 100 nL/s.
3. Réglez le contrôleur pour qu’il injecte et libère une petite quantité de virus de l’aiguille afin de s’assurer que la pointe de l’aiguille n’est pas bloquée. Essuyez l’excès de virus avec une lingette de laboratoire.
   REMARQUE : Une seringue Hamilton munie d’une aiguille en acier peut être utilisée comme solution de rechange aux pipettes en verre tiré.
4. Positionnez le micromanipulateur de manière à ce que l’échelle de Vernier soit visible et positionnez l’aiguille sur la ligne médiane de la moelle épinière.
   REMARQUE : La ligne médiane peut parfois être localisée par un gros vaisseau sanguin passant sur la surface antérieure de la moelle épinière. Cependant, cela peut varier d’un rat à l’autre, et le ciblage de la ligne médiane doit être confirmé par comparaison avec un processus épineux intact.
5. Dirigez l’aiguille latéralement de 0,8 mm à l’aide de l’échelle de Vernier sur le micromanipulateur.
6. Abaissez l’aiguille jusqu’à la moelle épinière jusqu’à ce qu’elle indente, mais ne perfore pas, la dure-mère. À l’aide d’un mouvement de torsion rapide, percez la dure-mère avec l’aiguille jusqu’à ce qu’elle s’enfonce à une profondeur de 1,5 mm.

7. Injection du virus dans la moelle épinière

1. Une fois l’aiguille en place, programmez l’injecteur pour qu’il injecte à un débit de 400 nL/min. Vérifiez que le virus pénètre dans la moelle épinière en observant la progression du front du colorant. Il ne doit pas y avoir de fuite ou de renflement évident du tissu de la moelle épinière. Si des fuites sont observées, celles-ci peuvent parfois être atténuées en réduisant la vitesse d’injection à 200 nL/min.
2. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille reposer dans la moelle épinière pendant 2 à 5 minutes (selon le volume injecté) pour faciliter la diffusion du virus.
3. Retirez lentement l’aiguille et passez au site d’injection suivant. Injectez 1 μL de virus dans chacun des 6 sites régulièrement espacés d’environ 1 mm sur la longueur du tissu rachidien L1-L4. La même aiguille peut être utilisée pour chaque injection tant qu’elle continue de fonctionner correctement.

8. Fermeture de la plaie et soins postopératoires

1. Retirez l’animal du support de la colonne vertébrale et retirez les écarteurs ou les crochets utilisés pour écarter les muscles latéraux. Assurez-vous que la plaie est exempte de tous les débris avant de la fermer.
2. Suturez le muscle à l’aide d’une suture catgut chromique 4.0. Coupez les fils de suture près du nœud pour réduire le risque d’irritation interne de la peau.
3. Agrafez la peau fermée à l’aide de pinces à bobine de 9 mm. Pour permettre une cicatrisation optimale, alignez les bords de la peau avant de l’agrafer.
4. Placez l’animal sur un coussin chauffant à convection d’eau et surveillez jusqu’à ce qu’il soit réveillé.
5. Injectez 5 à 10 ml de solution saline stérile par voie sous-cutanée pour reconstituer les liquides et un antibiotique tel que la céfazoline pour prévenir l’infection. Lorsque l’animal est ambulatoire, remettez-le dans sa cage d’origine et donnez-lui les premiers analgésiques. Surveillez les rats pour détecter tout signe de douleur et de détresse, et traitez-les conformément à la procédure approuvée par le comité de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) pour soulager la douleur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#10 Lames de scalpel	Roboz	RS-9801-10	À utiliser avec le scalpel.
Seringues de 1 ml	Becton, Dickinson and Company	309659	Pour l’injection IP d’anesthésique, les injections de rappel d’anesthésique potentielles et les injections d’antibiotiques.
Seringues de 10 ml	Becton, Dickinson and Company	309604	Pour injecter une solution saline à l’animal, après l’opération.
4.0 Suture Catgut chromique	DemeTECH	NN374-16	Pour relier le muscle lors de la fermeture.
48000 Micropipette Beveler	World Precision Instruments	32416	Utilisé pour biseauter les pointes des tubes capillaires en verre tirés pour former des aiguilles en verre fonctionnelles.
Solution d’iode à 5 %	Purdue Products L.P.	L01020-08	Pour une utilisation dans la stérilisation du site chirurgical.
70 % Éthanol	N/A	N/A Pour	la stérilisation des aiguilles de verre nouvellement préparées, des modèles animaux pendant la préparation chirurgicale et des mains du chirurgien pendant l’opération, ainsi que tous les autres maintenances mineures de stérilité.
Anesthésique (solution de kétamine/xylazine)	Zoetis	240048	Pour maintenir l’animal dans le bon plan de conscience pendant la chirurgie.
Antibiotique (Cefazolin)	West-Ward Pharmaceuticals	NPC 0143-9924-90	À injecter par voie sous-cutanée pour prévenir l’infection post-opératoire.
Stérilisateur à billes	CellPoint	5-1450	Pour stériliser à chaud les instruments chirurgicaux.
Bonewax	Fine Science Tools	19009-00	Pour sceller l’os en cas de saignement osseux.
Cautériseur	Outils scientifiques fins	18010-00	Pour sceller toutes les artères ou veines sectionnées lors d’une intervention chirurgicale afin d’éviter une perte de sang excessive.
Balance numérique	Okaus	REV.005	Pour peser l’animal pendant la préparation chirurgicale.
Accessoire d’aiguille flexible	World Precision Instruments	MF34G-5	Pour nettoyer les aiguilles de verre et charger de l’huile rouge dans les aiguilles de verre.
Gelfoam	Pfizer	H68079	Pour sceller l’os en cas de saignement osseux.
Tubes capillaires en verre	World Precision Instruments	4878	Pour les aiguilles en verre tirées - doit être conçu pour les injecteurs de nanolitres.
Tondeuse à cheveux	Oster	111038-060-000	Pour dégager le site chirurgical des cheveux.
Hémostats	Roboz	RS-7231	Pour un usage général en chirurgie.
Kimwipes	Kimtech	34155	Pour un usage général en chirurgie.
Pince incurvée à pointe moyenne	Roboz	RS-5136	Pour une utilisation générale en chirurgie.
Micromanipulateur avec échelle Vernier	Kanetec	N/A	Pour un ciblage précis pendant l’opération.
Microciseaux	Roboz	RS-5621	Pour couper le verre s’échappe des tubes capillaires en verre fraîchement tirés.
Microscope avec échelle de lumière et de vernier Oculaire	Leitz Wetzlar	N/A	Utilisé pour visualiser et mesurer le biseautage des tubes capillaires en verre tiré en aiguilles de verre fonctionnelles.
Contrôleur de pompe à microseringue	World Precision Instruments	62403	Pour contrôler le taux d’injection.
Nanoliter 2000 Pompe Tête Injecteur	World Precision Instruments	500150	Pour charger et injecter le virus de manière contrôlée.
Extracteur d’aiguille	Narishige	PC-100	Pour chauffer et séparer les tubes capillaires en verre afin de former des aiguilles en verre.
Pommade ophtalamique	Dechra Veterinary Products	RAC 0119	Pour protéger les yeux de l’animal pendant la chirurgie.
Parafilm	Bemis	PM-996	Pour aider au chargement du virus dans le nano-injecteur.
Aiguilles PrecisionGlide (25G x 5/8)	Becton, Dickinson and Company	305122	À utiliser avec les seringues de 1 ml et 10 ml pour permettre l’injection du modèle animal.
Pince à dents de rat	Roboz	RS-5152	Pour la préhension des apophyses épineuses.
Red Oil	N/A	N/A	Pour fournir une façade permettant de visualiser le virus pénétrant dans les tissus pendant l’injection.
Enrouleurs	Roboz	RS-6510	Pour maintenir ouverte la plaie chirurgicale.
Comprimés Rimadyl	Bio Serv	MP275-050	Pour la gestion de la douleur après l’opération.
Rongeurs	Roboz	RS-8300	Pour enlever du muscle de la colonne vertébrale pendant la chirurgie.
Poignée de lame de scalpel	Roboz	RS-9843	Pour trancher la peau ouverte et le coussinet adipeux d’un modèle animal pendant la chirurgie.
Ciseaux	Roboz	RS-5980	Pour une utilisation générale en chirurgie.
Clips de plaie en acier inoxydable	CellPoint	201-1000	Pour lier la peau de la plaie chirurgicale lors de la fermeture.
Pince pour dégrafage	Kent Scientific	INS750347	Pour retirer les agrafes, si elles sont mal appliquées.
Tissu stérile	Phenix Research Products	BP-989	Pour fournir une surface stérile pour l’opération.
Applicateurs stériles à embout de coton	Puritan	806-WC	Pour absorber le sang dans la plaie chirurgicale tout en maintenant la stérilité.
Gaze stérile	Covidien	2146	Pour nettoyer la zone chirurgicale et les outils chirurgicaux tout en maintenant la stérilité.
Saline stérile	Baxter Healthcare Corporation	281324	Pour une utilisation dans la purification du sang et pour le remplacement des fluides après la chirurgie.
Gants chirurgicaux	N/A	N/A	: Pour une utilisation par le chirurgien pour maintenir le champ stérile pendant l’opération.
Coussin chauffant chirurgical	N/A	N/A	Pour maintenir la température corporelle du modèle animal pendant l’opération.
Microscope chirurgical	N/A	N/A	Pour une meilleure visualisation de la plaie chirurgicale.
Agrafeuse chirurgicale	Kent Scientific	INS750546	Pour appliquer les agrafes.
Pompe à eau de thérapie thermique T/Pump	Gaymar	TP500C	Pour pomper de l’eau chaude dans le coussin chauffant à convection d’eau.
Coussin chauffant par convection d’eau	Baxter Healthcare Corporation	L1K018	À utiliser dans la zone de récupération post-opératoire pour maintenir la température corporelle de l’animal inconscient.
Crochets lestés	N/A	N/A	Pour maintenir ouverte la plaie chirurgicale.