Ultrasons focalisés de haute intensité pour bloquer les potentiels d’action nerveuse dans un modèle de rat diabétique

Source : Lee, Y. F., et al. Un outil à ultrasons pour le bloc de conduction nerveuse dans des modèles de rats diabétiques. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’utilisation des ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU) pour bloquer les potentiels d’action du nerf sciatique au muscle gastrocnémien dans un modèle de rat diabétique. Lors de l’administration du faisceau HIFU au nerf, une diminution du signal musculaire confirme le potentiel de HIFU en tant que thérapie non invasive pour le soulagement de la douleur neuropathique diabétique.

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Blocage de la conduction nerveuse in vivo avec le transducteur à ultrasons focalisés de haute intensité (HIFU)

REMARQUE : L’expérience in vivo commence à la semaine 5 après une injection de 50 mg/kg de streptozotocine (STZ).

Effectuez des procédures sur les animaux avant de bloquer les potentiels d’action musculaire composés (CMAP) avec la sonication HIFU.
1. Stérilisez les outils chirurgicaux (scalpel, ciseaux, pinces et crochet en verre) dans un autoclave avant l’opération.
2. Anesthésier les rats par injection intrapéritonéale d’un mélange de tilétamine/zolazépam (40 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou par inhalation de 1,75 % d’isoflurane à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane. Placez les rats sur un coussin chauffant pour maintenir leur température corporelle.
3. Positionnez les rats pour la chirurgie en décubitus ventral. Appliquez la pommade pour les yeux. Étendez la patte du rat et pincez la surface plantaire du pied avec les ongles pour déterminer la profondeur de l’anesthésie. Si les rats présentent des réponses de retrait, appliquez une anesthésie supplémentaire.
4. Retirez les poils de la cuisse et du bas du dos des rats à l’aide d’une tondeuse électrique. Appliquez de l’iode liquide avec de la gaze propre sur le site chirurgical et déplacez circulairement la gaze vers l’extérieur du site chirurgical. Utilisez un tampon imbibé d’alcool pour essuyer l’iode liquide avec le même mouvement circulaire. Cette expérience est réalisée sur les sites chirurgicaux gauche et droit. Répétez la procédure sur l’autre site chirurgical lors de l’exécution de l’étape suivante de la procédure.
5. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles ou d’un scalpel, faites une incision de la peau au niveau de la cuisse dorsale. Utilisez des ciseaux chirurgicaux émoussés pour séparer soigneusement le tissu sous la peau et fixez la peau avec des crochets cutanés. Le fémur peut être vu à l’intérieur des muscles.
6. Utilisez des ciseaux pour séparer soigneusement les muscles parallèles au fémur jusqu’à ce que les fibres du nerf sciatique de mi-cuisse qui sont intégrées dans les muscles soient visibles. Utilisez soigneusement un crochet en verre pour séparer le nerf sciatique de la mi-cuisse des tissus conjonctifs et des muscles environnants.
Positionnez le nerf sciatique dans la zone focale HIFU à l’aide d’un fixateur nerveux sur mesure (Figure 1 et Figure 2).
REMARQUE : Le fixateur nerveux sur mesure se compose de 3 composants (Figure 2). Tous les composants sont en polyméthacrylate de méthyle transparent (PMMA). Le filetage extérieur de la structure supérieure du composant I mesure 2,5 mm de haut et est de 0,7 mm (Figure 3A). Le puits central est un trou de 4,0 mm de diamètre traversant le composant I. L’ouverture inférieure du puits est scellée par une feuille de ruban adhésif. Le diamètre de la fente est de 1,2 mm et la distance entre le plan central de la fente et la surface supérieure du composant I est de 3,1 mm. La composante II se compose d’un corps principal, de quatre pattes et de la structure inférieure (figure 3B). Le filetage intérieur de la structure inférieure est de 2,5 mm de haut et M10XP0.7 pour s’adapter au filetage extérieur du composant I. Le diamètre du trou central est le même que celui du puits central du composant I. Les dimensions du corps principal sont de 32 mm de diamètre et de 5,4 mm d’épaisseur. Quatre pieds sont déployés symétriquement. Deux pattes courtes identiques sont conçues pour l’alignement, et deux pattes longues identiques servent à s’accrocher au composant III. Le diamètre extérieur et la hauteur du composant III sont de 41 mm et 9,2 mm. Le filetage intérieur est de type M36XP1.0 et le trou traversant a un diamètre de 27,5 mm (Figure 3C). Le cône est un cône creux avec une ouverture supérieure de 84 mm de diamètre et une ouverture inférieure de 27,5 mm de diamètre. La hauteur est de 57,5 mm (Figure 4A).
1. Avant l’expérience, trempez le fixateur de nerfs acrylique sur mesure dans une solution d’eau de Javel pendant 30 à 60 min, puis trempez-le dans de l’eau stérile.
2. À l’aide d’un crochet en verre, soulevez le nerf avec précaution et placez-le dans la fente du composant I.
3. Vissez le composant II sur le composant I. Remplissez le puits central du composant I avec la solution de Ringer pour la propagation ultrasonore et la préservation des nerfs.
4. Vissez le composant III au cône du boîtier HIFU. Amarrez le composant III avec le composant II à travers les quatre pieds du composant II.
  REMARQUE : Le centre géométrique des trois composants et la sonde sont alignés. La distance entre le nerf et le transducteur est égale à la distance focale, ce qui garantit que le nerf est à l’intérieur de la zone focale HIFU.
Insérez une paire d’aiguilles d’acupuncture à l’origine du nerf sciatique et l’autre paire dans le muscle gastrocnémien. Connectez chaque paire d’aiguilles au système d’acquisition d’électrophysiologie à l’aide d’un câble coaxial électrique (Figure 1).
REMARQUE : À une extrémité du câble se trouvent deux pinces crocodiles pour fixer deux aiguilles séparément, et à l’autre extrémité du câble se trouve un connecteur Neill-Concelman (BNC) à baïonnette pour relier le système. Les paires d’aiguilles d’acupuncture fonctionnent comme des électrodes de stimulation au niveau du nerf sciatique et des électrodes d’enregistrement au niveau du muscle gastrocnémien.
1. Réglez la fréquence d’échantillonnage et la bande passante du système d’acquisition électrophysiologique à 50 kHz et 70 Hz-3 kHz, respectivement. Appliquez un stimulus supra-maximal d’une largeur d’impulsion de 0,1 ms aux électrodes de stimulation à l’origine du nerf sciatique.
2. Enregistrez les CMAP à partir des électrodes d’enregistrement et amplifiez les CMAP à l’aide de l’amplificateur intégré dans le système d’acquisition d’électrophysiologie.
  REMARQUE : Utilisez l’amplificateur intégré dans le système d’acquisition d’électrophysiologie pour amplifier les signaux nerveux et enregistrez les CMAP à partir des électrodes d’enregistrement avec le système d’acquisition d’électrophysiologie.
Utilisez un transducteur HIFU commercial de 2,68 MHz pour supprimer les CMAP chez les rats neuropathiques diabétiques.
REMARQUE : Les spécifications du transducteur sont décrites comme suit : un bol sphérique monoélément avec un diamètre d’ouverture de 6 cm et une distance focale de 5 cm, et une zone focale ellipsoïde de 4 mm de profondeur et de 0,8 mm de largeur en champ libre.
1. Plongez le cône sphérique, le transducteur HIFU et le couvercle du cône dans le réservoir rempli d’eau dégazée. Insérez la sonde HIFU dans le cône sphérique et fixez le couvercle du cône à l’ouverture supérieure du cône sphérique à l’aide de six vis à tête (Figure 4B). Une fois que les bulles dans le cône sphérique ont été expulsées naturellement en raison de la faible densité des bulles par rapport à l’eau, scellez l’ouverture de l’extrémité avant du cône avec un ruban adhésif transparent de 0,03 mm d’épaisseur. Vissez le composant III sur le cône sphérique.
2. Retirez le transducteur HIFU avec le cône sphérique et le composant III du réservoir d’eau dégazée.
  REMARQUE : L’eau d’osmose inverse (OI) utilisée dans l’étude est l’eau purifiée par le processus d’osmose inverse. L’eau osmosée est bouillie pour expulser le gaz. Après refroidissement, l’eau dégazée est obtenue dans un réservoir individuel scellé.
Placez soigneusement le composant I dans l’espace entre le nerf et le muscle et positionnez le nerf dans l’espace du composant I. Effectuez les étapes 1.2.3 et 1.2.4 pour vous assurer que le nerf se trouve à l’intérieur de la zone focale de l’UFHI (Figure 2A).
Reliez un générateur de fonctions et un amplificateur de puissance radiofréquence. Connectez l’amplificateur de puissance au transducteur HIFU pour générer le faisceau HIFU. Réglez manuellement la tension de sortie du générateur de fonctions sur le transducteur HIFU via l’amplificateur de puissance. Désactivez manuellement le générateur de fonctions une fois le temps d’exposition HIFU écoulé. Observez le temps à l’aide d’une minuterie.
REMARQUE : L’intensité et l’énergie du faisceau HIFU utilisé dans cette étude sont respectivement de 2 810 W/cm² et 84 J/mm².
Simultanément, délivrez le stimulus via le système d’acquisition d’électrophysiologie (étape 1.3) et le faisceau HIFU via le système HIFU (étape 1.6) au nerf sciatique tout en enregistrant les CMAP. Augmenter graduellement l’exposition aux HIFU sur le nerf sciatique de 3 s, 5 s à 8 s jusqu’à ce qu’une diminution ou une inhibition de l’amplitude des CMAP soit observée.
1. Enregistrez les CMAP une fois par seconde pendant la livraison du faisceau HIFU. Après avoir observé le changement d’amplitude des CMAP, éteignez le système HIFU et cliquez manuellement sur l’icône d’enregistrement du logiciel d’acquisition d’électrophysiologie pour enregistrer les CMAP toutes les 2 minutes au début des 10 minutes, toutes les 5 minutes au cours des 30 minutes consécutives et toutes les 10 minutes au cours de la dernière phase jusqu’à ce que la durée d’enregistrement atteigne 2 h.
Séparez les composants II et III du fixateur nerveux (Figure 2) pour retirer le transducteur HIFU du site d’incision. Séparez les composants II et I pour libérer le nerf sciatique sécurisé. Suturez le site chirurgical du rat diabétique avec des sutures chromiques 4-0 après enregistrement des CMAP. Appliquez de l’iode liquide sur le site chirurgical pour prévenir l’infection.
1. Place les cages sur le coussin chauffant et laisse les rats récupérer dans leurs cages avant de les ramener à l’animalerie. Donnez aux rats de l’ibuprofène dans l’eau de boisson pendant 3 jours ou une injection intrapéritonéale de buprénorphine (0,05 à 0,1 mg/kg).
Insérez des électrodes de stimulation et d’enregistrement à l’origine du nerf sciatique et des muscles gastrocnémiens de rats neuropathiques diabétiques anesthésiés, comme décrit aux étapes 1.1.2 et 1.3, les jours 7, 14 et 28 après la sonication initiale de l’HIFU.

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue
Streptozotocin	Sigma	85882
Biopac MP36 système d’acquisition	Biopac Systems, Inc.
Transducteur HIFU	Sonic Concepts	H108
Générateur de fonctions	Agilent	33250A
Amplificateur de puissance	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vetent ongument	Dechra
Isoflurane vaporisateur	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurane	Attane

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