Imagerie de la dynamique subcellulaire du calcium dans les neurones de Caenorhabditis elegans

1. Préparation des vers pour l’imagerie

1. Préparation des tampons de gélose
   1. Préparer 3 mL de gélose à 10 % en dissolvant la gélose de qualité moléculaire dans M9 dans un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm et cuire au micro-ondes pendant plusieurs secondes.
      REMARQUE. La gélose fondue peut être conservée sur un bloc de chaleur jusqu’à 1 h ou peut être rafraîchie chaque fois que des tampons de gélose sont nécessaires.
   2. Placez une lame de microscope entre deux lames supplémentaires qui ont chacune deux couches de ruban adhésif de laboratoire (voir Figure 1A-i).
   3. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette de 1 000 μL (sans filtre) et utilisez-la pour pipeter une petite goutte de gélose sur la lamelle centrale (Figure 1A-i).
   4. Aplatissez la gélose en appuyant sur une autre glissière sur le dessus de la gélose (Figure 1A-ii).
   5. Après refroidissement, coupez la gélose en un petit disque à l’aide de l’ouverture d’un tube de culture en verre de 13 mm x 100 mm (figure 1A-iii), puis retirez la gélose environnante.
2. Préparation de la solution de roulement à vis sans fin
   1. Dissoudre la poudre de muscimol dans M9 pour créer un stock de 30 mM. Séparer en aliquotes de 50 μL et conserver à 4 °C.
   2. Décongeler une nouvelle aliquote de 30 mM de muscimol tous les 3 à 5 jours (et conserver à 20 °C pendant l’utilisation).
   3. Diluez un stock de muscimol de 30 mM dans un rapport de 1:1 avec des billes de polystyrène pour obtenir la solution de roulage.
3. Positionnement d’un ver pour l’imagerie
   1. Placez 1,6 μL de la solution roulante au centre de la plaque de gélose.
      REMARQUE : La quantité de liquide doit être ajustée pour l’imagerie d’animaux plus jeunes (moins) ou plus âgés (plus).
   2. À l’aide du pic à vis de votre choix (c.-à-d. un pic en verre ou en fil de platine), transférez un ver de l’âge désiré sans phénotype multi-vulve dans la solution roulante sur le tampon gélosé (Figure 1A-iv). note. Les données représentatives proviennent d’hermaphrodites âgés de 1 jour (souche GCaMP6f = FJH185 ; souche mitoGCaMP ; FJH597), qui peut être identifié par la présence d’une seule rangée d’œufs.
   3. Attendez ~5 minutes pour que le muscimol réduise le mouvement du ver, puis déposez une lamelle de 22 mm x 22 mm sur le dessus du tampon gélosée, limitant physiquement le mouvement du ver.
   4. Pour imager les neurites dans le cordon nerveux ventral, roulez le ver dans l’orientation indiquée sur les figures 1B et 1C en faisant glisser légèrement la lamelle.
      REMARQUE. Pour visualiser le cordon nerveux ventral, positionnez le ver avec la tête vers le haut et roulez le ver jusqu’à ce que l’intestin soit du côté droit de la partie proximale et de la partie distale du ver à gauche (du point de vue du spectateur). Inversez cette orientation (Figure 1C) pour l’imagerie des neurites dans le cordon nerveux dorsal.
4. Montage du ver sur un microscope
   1. Placez une goutte d’huile d’immersion sur la lamelle avant de la monter sur la platine du microscope.
   2. Trouvez le ver à l’aide d’un objectif à faible grossissement (10x) en fond clair.
   3. Passez à l’objectif 100x et ajustez la mise au point.
   4. Localisez le neurite AVA à l’aide de l’éclairage du GCaMP ou du mitoGCaMP avec le laser d’imagerie 488 nm.
      REMARQUE : Utilisez de petits ajustements pour éviter d’écraser le ver ou de retirer la lamelle.

2. Acquisition de flux d’images haute résolution

1. Imagerie GCaMP in vivo
   1. Réglez le temps d’exposition à 20 ms.
   2. Ajustez le laser d’imagerie et les paramètres d’acquisition jusqu’à ce que la fluorescence basale du GCaMP se situe au milieu de la plage dynamique de la caméra. Reportez-vous à la discussion pour des suggestions sur l’optimisation des paramètres d’imagerie à l’aide d’autres configurations de microscopie.
      REMARQUE : Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 50 % et atténuation = 1. Modifiez les paramètres d’acquisition supplémentaires comme suit : gain multiplicateur d’électrons EM = 200 et gain du préamplificateur = 1.
   3. Une fois que le neurite AVA est localisé à l’aide de la fluorescence GCaMP à un grossissement de 100x, réglez le correcteur de dérive Z (ZDC, voir le tableau des matériaux) sur une plage de ±30 μm et lancez la mise au point automatique continue. Corrigez manuellement le plan focal si nécessaire avant l’imagerie.
   4. Acquérez un flux d’images avec un grossissement de 100x. Des durées allant jusqu’à 10 minutes peuvent être atteintes avec la configuration utilisée dans cette étude.
2. Imagerie mitoGCaMP in vivo
   1. Suivez les étapes 2.1.1 à 2.1.2 si nécessaire pour acquérir la fluorescence basale mitoGCaMP dans la plage moyenne pour la plage dynamique de la caméra.
      REMARQUE. Pour la configuration optique utilisée dans cette étude, réglez le laser d’imagerie 488 nm sur les paramètres de sortie suivants : puissance laser = 20 % et atténuation = 10. Modifiez les paramètres d’acquisition comme suit : Gain EM = 100 et gain du préamplificateur = 2.
   2. Une fois que les mitochondries du neurite AVA sont localisées à l’aide de la fluorescence mitoGCaMP, réglez le ZDC comme décrit ci-dessus à l’étape 2.3.
   3. Acquérez un flux d’images avec un grossissement de 100x.

Figure 1 : Montage et roulement de C. elegans pour l’imagerie du cordon nerveux ventral. (A) Une illustration des étapes de préparation des tampons de gélose et de sélection d’une seule vis sans fin dans une solution roulante. (B) Un exemple de position d’une vis sans fin avant qu’elle ne soit repositionnée pour l’imagerie. La flèche rouge indique la nécessité d’un roulement de la vis sans fin vers la droite, ce qui peut être réalisé en faisant glisser la lamelle vers la droite (flèche bleue). Barre d’échelle = 50 μm. (C) L’orientation correcte nécessaire pour visualiser le cordon nerveux ventral. Remarque : L’intestin se trouve du côté droit de l’observateur (à l’aide d’un microscope vertical) dans la moitié proximale, puis du côté gauche dans la moitié distale.