Nous décrivons une In vitro Méthode pour schistosomules culture du parasite plathelminthes Schistosoma mansoni, En passant par la récolte et la transformation des cercaires infestantes des escargots d'eau douce Biomphalaria glabrata intermédiaires d'accueil.
Dans cet article
Résumé
Résumé
Schistosomes sont les agents responsables de la schistosomiase, une maladie chronique débilitante qui touche plus de 200 millions de personnes au niveau mondial et se classe deuxième au paludisme dans les maladies parasitaires en termes de santé publique et socio-économiques (1-4). Schistosomes sont des vers trématodes, avec un cycle de vie complexe échangeant entre une vie parasitaire dans mollusques hôtes et de mammifères avec des intervalles de libre-natation étapes. En bref, la nage libre cercaires infecter un hôte mammifère en pénétrant la peau à l'aide de protéases sécrétées, au cours de laquelle les cercaires perdent leur queue, se transformant en schistosomules. Les schistosomules doit désormais échapper au système immunitaire de l'hôte, de développer un intestin pour la digestion des globules rouges, et de migrer si les poumons et la circulation portail en route vers leur destination finale dans le système porte hépatique et éventuellement les veines mésentériques (pour S. mansoni) où mâle et femelle et s'accoupler deux vers, producing centaines d'œufs par jour. Certains des œufs sont excrétés par le corps dans l'eau douce, où les œufs éclosent en nage libre miracidiums (5-10). Le miracidium infecter les espèces d'escargots spécifiques et se transforment en sporocystes mère et la fille, qui, à son tour, produisent des cercaires infectantes, complétant ainsi le cycle de vie. Malheureusement, le cycle de vie des schistosomes ne peuvent pas être cultivées in vitro, mais cercaires infestantes peut être transformé en schistosomules et les schistosomules peuvent être cultivées pendant des semaines pour l'analyse du développement schistosome in vitro ou l'analyse des microréseaux. Dans ce protocole, nous fournissons une description visuelle de la transformation des cercaires et culture in vitro de schistosomules. Nous nous débarrassons de cercaires infectieuses de l'escargot Biomphalaria glabrata hôte et manuellement les transformer en schistosomules en détachant leurs queues en utilisant un émulsifiant double aiguille. In vitro, la transformation des cercaires et des techniques de culture d schistosomulesescribed éviter l'utilisation d'un hôte mammifère, ce qui simplifie la visualisation des schistosomes et faciliter la collecte du parasite pour l'analyse expérimentale. transformation in vitro et des techniques de culture de schistosomes ont été faites depuis des années (11, 12), mais pas de protocoles visuels ont été développés qui sont à la disposition de toute la communauté.
Protocole
Mesures de sécurité:
Cercaires de schistosomes peuvent directement pénétrer la peau sans les besoins d'une coupure ou pores et provoquer la schistosomiase maladies chroniques. S. mansoni est un niveau de biosécurité 2 organisme, donc un équipement de protection individuelle et des mesures de sécurité appropriées doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des cercaires infectantes. La plupart des équipements nécessaires à la croissance et à transformer les schistosomes est standard, à quelques exceptions près clés indiqués dans le tableau à la fin du protocole. Tous les travaux des cercaires devrait être fait dans une pièce isolée. Schistosomules doivent être cultivées dans un récipient stérile, la biosécurité approuvé le capot. Deux couches de nitrile ou des gants en latex doivent être portés, tout comme une blouse, une paire de chaussures imperméables, pantalons avec des trous ou de déchirures, et les protecteurs manches étanches pour vos poignets et des bras. En cas de déversement accidentel, pulvériser immédiatement zone contaminée avec de l'éthanol à 70% ou eau de Javel à 10%, frottant vigoureusement si sur votre personne.Ce sera suffisant pour désactiver le parasite, mais toutes les infections possibles doivent être signalés et pris au sérieux. Bien que schistosomules ne sont pas naturellement infectieux, directives institutionnelles varient et doivent être consultées pour déterminer si BSL2 précautions sont nécessaires lors des étapes de la vie non infectieuses. Désinfectez toutes les surfaces qui entrent en contact avec une substance potentiellement infectieux après l'expérience est effectuée et jeter les déchets dans un contenant approuvé biohazard.
REMARQUE: bacs de couverture escargot hôte 1 à 2 jours avant la mue et protègent de la lumière
1. La récolte des cercaires de l'escargot hôte
- Remplir un gobelet propre et libre de 500mL détergents à mi-chemin plein avec de l'eau distillée équilibrés à température ambiante. Si vous travaillez avec des escargots hôtes infectées par miracidiums à des dates différentes, utiliser un bécher séparé pour chaque date d'infection (Ceci est particulièrement important si les escargots seront réutilisées pour future expériences). La taille du gobelet peut aussi être inférieur en fonction de l'expérience de l'utilisateur.
- Recueillir des mollusques hôtes infectés que vous souhaitez jeter et de les déposer avec précaution dans le bécher à l'aide d'un poisson d'aquarium standard net et une pince à usage général selon les besoins.
- Bécher place sur un bac de nettoyage d'urgence environ 8 à 12 pouces au-dessous d'une source incandescente. Laisser reposer pendant 1-2 heures, sous la lumière. Cercaires quitter le mollusque hôte lorsqu'il est exposé à la lumière.
- Soigneusement filtrer les escargots à partir du mélange des cercaires. Prenez des précautions supplémentaires, sous forme de mélange est très contagieux. Rappelez-vous, les cercaires peuvent directement pénétrer la peau humaine!
- Remplacer mélange sous source de lumière pendant environ 15 minutes, ce qui permet une matière particulaire de déchet à régler.
- Transfert cercaires dans un erlenmeyer propre à l'aide d'une pipette, en évitant les débris au fond du bécher. Placer le ballon à environ un angle de 45 ° sur la glace dans l'obscurité pendant45 - 60 minutes, ce qui permet cercaires de s'installer dans un coin.
- Utiliser une pipette 50 ml pour éliminer 75 à 90% du surnageant et le déposer dans le bécher contenant l'eau de Javel à 10% ou 70% d'éthanol, en prenant soin de ne pas laisser les gouttes d'eau contenant des cercaires goutte à goutte de la pipette.
- Agiter le flacon d'Erlenmeyer contenant des cercaires doucement pour remettre en suspension les cercaires en solution. Utiliser une pipette pour transférer l'échantillon à stériles tubes de 50 ml coniques. Placer les tubes à nouveau sur la glace pendant 20 minutes dans l'obscurité. Cercaires se déposent vers le bas du tube dans l'obscurité.
2. Transformation manuelle des cercaires à schistosomules
Avant de commencer: Assurez-RPMI 1640 complet (RPMI, 5% de sérum fœtal bovin, 1X Pen / Strep) et chaude à 37 ° C. (Il est crucial que le sérum fœtal bovin utilisé a été inactivée par incubation de 56 ° C pendant 1 heure comme schistosomes peuvent être sensibles à compléter).
- Dans une hotte biohazard, retirezsurnageant jusqu'à 5 à 10 ml de solution dans chaque conique 50 ml à l'aide d'un dispositif de pipetage ou de vide.
- Joindre un calibre 22 à double extrémité, Luer lok émulsifiant aiguille d'une seringue de taille appropriée.
- Aspirer lentement le mélange dans la seringue. Recueillir des cercaires de tous les tubes de 50 ml dans une seringue. Soyez attentif de gouttes.
- Tournez avec précaution la seringue au cours de telle sorte que l'extrémité de l'aiguille seule est en place. Fixer une autre seringue de ce côté-ci de l'aiguille d'émulsification.
- Passer le mélange à travers l'aiguille un total de 40 fois (20 fois aller et retour) pour transformer les cercaires.
- Positionner verticalement les seringues de telle sorte que le mélange est contenu dans la seringue en bas et en haut de la seringue est vide. Retirer la seringue et désinfecter haut dans l'éthanol à 70%.
- Goutte à goutte dépôt mélange dans un récipient propre de hauteur x 50mm paroi 100mm plat en pyrex ou cristallisoir. Désinfectez l'aiguille et la seringue dans l'éthanol à 70%.
- Ajouter 37 ° C milieu RPMI 1640 complet de sorte que la inférieure de la boîte de Petri est entièrement recouverte, comme une plaque de coulée bouillon Luria.
- Agiter doucement pour recueillir schistosomules dans le centre de la boîte de Pétri. Éviter les éclaboussures.
Remarque: Il peut être utile de désactiver la lumière de hotte pour cette étape de façon à mieux visualiser les schistosomules dans le centre. - Déposer immédiatement schistosomules concentrés dans un nouveau de 12 puits de plaque de culture cellulaire et en utilisant un compte-gouttes stérile.
- Répétez jusqu'à ce que 2.9 et 2.10 schistosomules ne sont plus présents dans le centre du plat (environ 10 fois). Déposer chaque collecte ultérieure dans un endroit bien frais.
- Remplir chaque puits jusqu'à mi-course (~ 1,5 ml) avec milieu RPMI complet préchauffé.
- Visualisez sur un microscope inversé pour vérifier la présence de schistosomules et l'absence de cercaires.
- Cultivez les schistosomules dans un incubateur à CO 2 réglée à 37 ° C et 5% de CO 2.
3. Les résultats représentatifs:
ove_content "> Dans l'attente de transfert des schistosomules transformés en milieux de culture, la visualisation en vertu d'un champ lumineux inversé microscope (voir tableau équipement pour un exemple) devrait donner une image similaire à la figure 1, dans laquelle seuls schistosomules transformées sont présents dans le puits. contaminants potentiels pourrait inclure des cercaires intacte, coupées queues cercariens, ou d'autres débris. Si aucun microscope inversé est disponible, un microscope standard ou même un champ de dissection sera suffisante pour visualiser les schistosomules. Notez que cette procédure ne permet pas toujours de transformer 100% de cercaires.
Figure 1: schistosomule Transformé
Figure 2: Severed cercaires et Tails
Discussion
Plusieurs problèmes potentiels pourraient survenir pendant la procédure de transformation, mais ce protocole est conçu pour éviter la plupart de ces problèmes. Un danger potentiel est le colmatage de l'aiguille émulsifiant, qui survient généralement à cause de débris laissés par l'exploitation à l'étape 1.3. Veillez à conserver toutes les particules de s'installer dans l'étape 1.5 et de transférer les cercaires soigneusement à l'étape de 1,6 à éviter ce problème. En outre, comme décrit précédemment, travaillant à l'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique, l'utilisation d'équipements de protection individuelle (masques protecteurs même) et d'éviter une pression excessive sur les seringues est conseillé.
Détaché queues cercariens peuvent être visualisés dans les médias, ce qui est révélateur d'une mauvaise séparation lors de l'étape 2.9. Les queues de présenter une motion de spasme comparable et ont une forme distincte (voir la figure 2), et thusly sont facilement distinguables des schistosomules. Les queues peuvent être enlevées par lavage des schistosomules en excès de RPMIcompléter les schistosomules permettant de régler. Les queues restera flottant qui peut être aspirées.
Si cercaires intacts sont présents dans les médias, la transformation à l'étape 2.5 a été pas exécuté correctement. Une image d'une cercaire intacte est représenté dans la figure 3b pour référence. Si ce problème se produit, s'assurer que l'aiguille émulsifiant utilisé est de la bonne taille. En outre, le nombre de fois que le mélange des cercaires est passé par l'aiguille peut être augmenté, mais 40 fois est généralement beaucoup plus que suffisant pour approcher cisaillement 100% des queues cercariens.
Transformation des cercaires en schistosomules a été décrite pour la première en 1974 par Colley et Wikel (13). Depuis lors, la préparation des schistosomules a été fait en utilisant soit la stratégie de cisaillement avec une aiguille et d'une seringue comme décrit dans le présent protocole, ou en utilisant une approche vortex et séparés par des gradients de Percoll (14, 15) ou tourbillonnant comme l'a démontré dans le présent document. Ces deux techniques de préparation de schistosomules sont magnifiquement décrite par Fred Lewis (16) et pour plus d'informations poursuite de la culture du schistosomules de croissance à long terme peut être trouvée au Centre de ressources Schistosome NIAID ( www.schisto-resource.org ).
Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce projet a été financé par des fonds Case Western Reserve University de démarrage fournis à E. Jolly. Escargots infectés ont été fournies par le Centre de ressources Schistosome, NIH-NIAID (NIAID Marché n HHSN272201000009I). Nous remercions également Chris King et Ronald Blanton pour le soutien à la sécurisation des escargots infectés de schistosomes et pour des discussions utiles.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | |
| 22g x 2-7/8 "émulsifiant aiguille | Fisher Scientific | 14 à 825-17G | |
| Milieu RPMI 1640 1X (500ml) | Invitrogen | 11835030 | |
| Sérum foetal bovin (FBS) inactivé par la chaleur | Invitrogen | 10082139 | |
| Pénicilline / Streptomycine (100X) | Invitrogen | 15070063 | |
| Cristallisoir (100mm) | Fisher Scientific | 08-741D | |
| Pinces à usage général | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Petco Aquarium net pour les crevettes de saumure | Petco | SKU: 1190954 |
Références
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Réimpressions et autorisations
