Transplantation de cellules précurseurs d’interneurones dans le cerveau d’un bébé souris

Résumé

Source : Quattrocolo, G., et al. Transplantation homochronique de précurseurs d’interneurones dans des cerveaux de souris postnatals précoces. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre la transplantation de cellules précurseurs d’interneurones dans le cerveau d’une souris néonatale en utilisant une approche homotopique ou hétérotopique. La procédure consiste à sécuriser un chiot receveur anesthésié, à identifier la région cérébrale cible et à injecter une suspension de cellules précurseurs dérivées d’un chiot donneur au même stade de développement. Après l’injection, le petit est transféré dans un coussin chauffant pour la récupération, ce qui permet d’évaluer ultérieurement la survie et la maturation des cellules du donneur.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Élimination du cerveau de souris P0-P2

1. Juste avant de commencer la procédure, remplissez plusieurs boîtes de Pétri avec du liquide céphalo-rachidien artificiel réfrigéré et caroxygéné (sACSF). Remplissez également le(s) tube(s) de prélèvement avec ~25 mL de sACSF.
2. Enveloppez un chiot postnatal de jour 0 à 2 (P0-P2) dans un parafilm ou un gant et placez-le bien couvert sous la glace. Réglez une minuterie sur 5 minutes et démarrez-la. Après ce temps, retirez le chiot et vérifiez qu’il ne répond pas au pincement de la patte arrière.
3. Décapitez le chiot et récupérez la tête dans une boîte de Pétri remplie de sACSF. Coupez la peau le long de la ligne médiane pour exposer le crâne.
4. Localisez l’ouverture du crâne au niveau du cerveau postérieur ou de la moelle épinière et insérez une extrémité de la pince le long de la partie dorsale du crâne. Saisissez doucement le crâne sur la ligne médiane et « décollez » les morceaux latéralement pour exposer le cerveau, en faisant attention de ne pas endommager le cerveau.
5. Lors de l’ablation des parties dorsale et latérale du crâne, utilisez la pince ou la spatule pour retirer doucement le cerveau du crâne en le cachant sous la surface ventrale du cerveau, en essayant de ne pas endommager aucune zone. Placez le cerveau dans une autre boîte de Pétri remplie de sACSF carboxygéné. note: Nous présentons deux stratégies différentes pour disséquer l’hippocampe, le striatum et le cortex. La première stratégie (étapes 2.1-2.10) est utile pour n’importe quelle lignée de souris, tandis que la deuxième stratégie (étapes 3.1-3.7) nécessiterait une souris rapporteure fluorescente pour séparer proprement le striatum du globus pallidus et d’autres structures cérébrales. Si le striatum n’est pas souhaité, ignorez les parties spécifiques au striatum des deux techniques

2. Récolte du striatum, de l’hippocampe et du cortex, Technique #1

1. Placez le cerveau entier sur le moule de matrice de sectionnement, côté ventral vers le haut. Placez 1 lame de rasoir dans la partie la plus antérieure du cerveau (à travers le tractus olfactif antérieur).
2. Insérez une autre lame de rasoir juste en arrière de la première pour générer une tranche de 0,5 mm et placez une lame de rasoir supplémentaire à l’arrière de celle-ci.
3. Transférez ces tranches dans une boîte de Pétri avec du sACSF carboxygéné et placez le reste du cerveau dans une boîte séparée avec du sACSF. Transférez les coupes de striatum dans une lunette de dissection pour visualiser le striatum. Ces tranches doivent contenir de grandes parties du striatum antérieur et ne pas avoir d’hippocampe. Utilisez une lunette de dissection fluorescente avec Nkx2.1-Cre^+/- ; Ai9^+/- pour différencier le signal tdTomato striatal faible du signal tdTomato fort du globus pallidus.
4. Avec ou sans fluorescence, pincez le striatum des deux hémisphères sur toutes les sections et transférez les morceaux de striatum dans un tube de 50 mL correctement étiqueté avec sACSF, stockez-le sur de la glace.
5. Émissez le cerveau le long de la ligne médiane à l’aide d’une pince ou d’une lame de rasoir et posez l’hémisphère de manière à ce que la surface médiale soit tournée vers le haut.
6. Retirez le tissu cérébral ventral (thalamus, ganglions de la base, etc.) en pinçant ce tissu avec une pince. Une fois terminé, l’hippocampe (une structure en forme de saucisse couvrant l’axe antéropostérieur le long du cortex dorsal) et la face ventriculaire du cortex doivent être clairement visibles.
7. Pour retirer l’hippocampe, insérez les pointes de la pince devant l’hippocampe antérieur et séparez doucement l’hippocampe du cortex en déplaçant la pince vers l’arrière et en pinçant le long de la bordure hippocampique-corticale. Transférez l’hippocampe isolé dans un tube de 50 mL correctement étiqueté avec sACSF, conservez-le sur de la glace.
8. Pour disséquer le cortex, placez le cortex hémiqué côté médial vers le bas. Ensuite, utilisez la pince pour pincer les parties les plus dorsales, ventrales, antérieures et postérieures du cortex pour laisser un morceau carré de cortex somatosensoriel médial, ~2 mm x 2 mm. Retournez le cortex de manière à ce que le côté médial soit vers le haut et exempt de tout excès de tissu non cortical (thalamus, ganglions de la base, etc.) sur la surface médiale si nécessaire. Transférez le morceau de cortex dans un tube de 50 ml correctement étiqueté avec sACSF, conservez-le sur de la glace.
9. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère pour collecter les régions de l’hippocampe et du cortex.
10. Répétez cette procédure pour tous les chiots, en vous assurant de replacer le sACSF dans les boîtes de Pétri entre les chiots pour vous assurer que le sACSF reste froid et frais.

3. Récolte du striatum, de l’hippocampe et du cortex, Technique #2

1. Placez le cerveau face ventrale vers le bas dans une boîte de Pétri recouverte de sylgard contenant du sACSF et épinglez-la à travers le cervelet et le cortex antérieur ou les bulbes olfactifs.
2. En commençant par un hémisphère, utilisez des pinces incurvées pour séparer doucement le cortex postérieur de l’hippocampe sous-jacent et d’autres tissus. Posez délicatement le cortex pelé à plat sur une boîte de Pétri. Répétez l’opération pour l’autre hémisphère. L’hippocampe et le striatum doivent être clairement visibles dans le cerveau exposé.
3. Utilisez une pince pour pincer un hippocampe sur la ligne médiane et peler l’hippocampe latéralement pour l’enlever. Placer dans un flacon de collecte sur de la glace et répéter avec d’autres hippocampes.
4. Pour le striatum, grattez doucement les bords du striatum pour le détacher des tissus environnants. Ensuite, retirez le striatum en le pinçant par le dessous et ajoutez-le dans le tube de collecte sur de la glace. Répétez l’opération pour l’autre striatum.
5. Des coupes corticales peuvent être prélevées comme décrit à l’étape 2.8.
6. Si vous utilisez une lignée de souris rapporteure transgénique (p. ex., Nkx2.1-Cre ; Ai9, Lhx6-GFP, etc.), transfère le striatum dans une boîte de Pétri avec sACSF et visualise sous une lunette de dissection fluorescente. À l’aide d’une pince, on peut retirer tout tissu non striatal du striatum (en Nkx2.1-Cre ; Ai9, enlèvent tous les tissus « brillants », car le globus pallidus a une éminence ganglionnaire médiale beaucoup plus élevée ou dérivée de MGE, densité cellulaire tdTomato+ par rapport au striatum). Répétez l’opération pour tous les striatum.
7. Répétez cette procédure pour tous les chiots, en vous assurant de replacer le sACSF dans les boîtes de Pétri entre les chiots pour vous assurer que le sACSF reste froid et frais.

4. Générer des dissociations unicellulaires

1. Une fois la dissection terminée, préparez une solution de Pronase à 1 mg/mL en pesant 10 mg de Pronase et en la dissolvant dans 10 mL de sACSF carboxygéné.
2. Transférez le tissu des flacons de prélèvement de 50 ml dans des tubes à fond rond de 5 ml contenant 2 ml de la solution Pronase-sACSF. Incuber le tissu pendant 20 minutes à température ambiante, en secouant/effleurant le tube 3 à 4 fois avec votre doigt pendant l’incubation pour mélanger les échantillons.
3. Au cours de cette incubation, préparer la solution de reconstitution : 1 % de sérum de veau fœtal (FBS, 100 μL) + DNAse (1 μL d’ADN mère 1:10 000) dans 10 mL de sACSF carboxygéné.
4. Après les 20 minutes, retirez soigneusement la solution de pronase pour ne pas perturber le tissu au fond et remplacez-la par 1 à 2 ml de la solution de reconstitution (le volume total dépend de la quantité initiale de tissu).
5. Dissocier mécaniquement le tissu en triturant le tissu avec les pipettes Pasteur préalablement préparées et polies au feu. En commençant par la pipette de grand calibre (~600 μm), aspirez et expulsez la solution tissulaire au moins dix fois pour briser le tissu. N’introduisez pas de bulles dans la solution. Répétez ce processus pour la pipette de calibre moyen et la pipette de petit calibre. La solution doit être trouble et aucun morceau de tissu transparent ne doit être visible dans les tubes de prélèvement.
6. Pipeter la solution de lysat cellulaire à travers un filtre de 50 μm dans des tubes coniques de 5 mL pour éliminer tout amas de cellules. Procéder avec ces solutions unicellulaires à la cytométrie en flux (ou éventuellement directement au comptage des cellules si aucun tri n’est nécessaire).

5. Préparation de solutions cellulaires purifiées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour la transplantation

1. À la réception des solutions cellulaires du cytomètre en flux, transférez la solution dans un (ou plusieurs) tubes coniques de 1,5 mL et faites tourner les cellules à 500 g pendant 5 min à 4^°C. Après la centrifugation, retirez le fluide de manière à ce qu’il reste ~20-40 μL dans le tube. Reconstituez les cellules dans ce milieu restant (et combinez la solution si plusieurs tubes étaient nécessaires).
2. Sur un petit morceau de parafilm, mélanger 2 μL de solution cellulaire + 8 μL de sACSF + 10 μL de colorant bleu trypan. Pipeter 10 μL dans un hémocytomètre avec couvercle de lame.
3. Comptez le nombre de cellules vivantes dans chacune des grilles carrées de 4 x 4 dans les coins de l’hémocytomètre à l’aide d’un compteur manuel de laboratoire standard (les cellules mortes seront bleues à cause du colorant) et faites la moyenne de ces 4 comptes. Multipliez ce nombre par 100 pour déterminer le nombre de cellules par μL.
4. Si nécessaire, ajustez le volume de sorte que les cellules soient à une concentration de 10 000 à 30 000 cellules/μL dans la solution de reconstitution. La concentration finale dépend de la quantité totale de cellules et du nombre souhaité de greffes. Garder les cellules sur de la glace pour la transplantation

6. Transplantation en chiots P0-2 WT

1. Enveloppez un chiot de type sauvage (WT) dans un parafilm ou un gant et placez-le bien couvert sous la glace. Réglez une minuterie sur 5 min et démarrez-la. Après ce temps, retirez le chiot et vérifiez qu’il ne répond pas au pincement de la patte arrière.
2. Pendant que le chiot est sur de la glace, mélangez la solution cellulaire en la pipetant plusieurs fois pour vous assurer que la suspension cellulaire est bien mélangée avant le chargement (mélangez les cellules avant de charger la micropipette pour chaque injection). Videz ensuite la micropipette de l’huile minérale et remplissez-la complètement avec la suspension cellulaire.
3. Placez le chiot anesthésié sur la boîte de Pétri avec sa tête posée sur le mastic adhésif de sorte que le haut de la tête soit relativement plat. Placez le ruban avec le trou en diamant sur la tête du chiot, en le tirant pour vous assurer que la peau est étirée et que la tête est ferme, mais que la souris est à l’aise et respire bien. Lambda doit être visible à travers le trou en diamant.
4. Déplacez le chiot fixé sous le Nanoject et abaissez la micropipette de sorte que la pointe de la micropipette soit directement au-dessus de lambda. Enregistrez les coordonnées x-y sur le manipulateur.
5. Ajustez les boutons du manipulateur pour déplacer la micropipette aux coordonnées souhaitées le long de l’axe médiolatéral et antéropostérieur de la tête : cortex somatosensoriel primaire ou cortex S1 → 1,0 mm antérieur et 1,0 mm latéral, hippocampe → 0,75-1,0 mm antérieur et 1,0-1,2 mm latéral, striatum → 2,0-2,2 mm antérieur et 1,5 mm latéral. Les coordonnées peuvent être légèrement ajustées pour compenser l’âge du petit (p. ex., P0 par rapport à P2) ou la souche des souris (p. ex., les souris CD1 sont plus grandes que et C57/B6 à P2).
6. Abaissez la micropipette jusqu’à ce qu’elle forme une petite concavité sur la peau. Tournez ensuite le bouton du manipulateur de l’axe z fermement mais doucement pour enfoncer la micropipette à travers la peau et le crâne afin de pénétrer dans le cerveau. Lorsque la micropipette pénètre dans le cerveau, la pression sur le crâne sera relâchée et la concavité disparaîtra.
7. Rétractez légèrement la micropipette jusqu’à ce que la pointe soit entourée d’un cône de peau, en forme de tente. Lisez les coordonnées le long des axes z : il s’agira du point zéro de l’axe z.
8. Abaissez la micropipette à la profondeur souhaitée : Cortex → 0,75-1,0 mm, Hippocampe → 1,2-1,5 mm, Striatum → 2,0-2,5 mm. La profondeur peut être légèrement ajustée pour compenser l’âge ou la tension du chiot.
9. Injectez la suspension cellulaire à l’aide du programme Nanoject III décrit ci-dessus. Une fois le programme d’injection terminé, attendez 15 à 20 s avant de rétracter lentement la micropipette pour minimiser les fuites de solution hors du site d’injection.
10. Si vous effectuez des injections bilatérales, remettez la micropipette à zéro au-dessus de lambda et déplacez-vous vers les coordonnées appropriées dans l’autre hémisphère. Alternativement, on peut faire deux injections dans le cortex du même hémisphère en déplaçant la micropipette 1 mm en avant de la première injection.
11. Une fois la transplantation terminée, retirez le ruban adhésif et transférez le chiot sur le coussin chauffant. Si nécessaire, marquez le chiot en coupant la queue ou les orteils. Une fois que le chiot a repris une couleur rouge et qu’il se déplace, remettez-le dans la cage avec la mère.

Matériaux