Transfection médiée par électroporation des ganglions de la racine dorsale de souris pour favoriser la régénération sensorielle des axones

Résumé

Source : Li, Q. et al. Étude de la régénération axonale des mammifères : électroporation in vivo du ganglion radiculaire dorsal de souris adulte. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre la transfection médiée par électroporation des neurones DRG de souris pour étudier la régénération axonale. Il décrit les étapes de l’administration des constructions d’acides nucléiques aux neurones DRG, de l’induction de lésions du nerf sciatique et de l’évaluation de la régénération axonale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection de ganglion de la racine dorsale (DRG)
   1. Injectez une solution anesthésique (diluez l’avertin dans une solution saline stérile à une concentration finale de 20 mg/mL, avec avertin 200 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour maintenir l’anesthésie avant l’injection de DRG.
   2. Chargez les plasmides de l’acide désoxyribonucléique (ADN) ou les oligonucléiques de l’acide ribonucléique (ARN) (1 μL par DRG) dans la pipette capillaire en verre.
   3. Insérez soigneusement l’extrémité de la pipette en verre capillaire dans le DRG.
   4. Injectez progressivement une solution de 1,0 μL de plasmides d’ADN ou d’oligos d’ARN dans le DRG à l’aide des systèmes de distribution de micro-injection intracellulaire (30 psi, 8 ms).
      REMARQUE : La durée de l’injection ne doit pas durer moins de 5 minutes.
2. Electroporation
   1. Déposez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur les pointes des électrodes.
   2. Nettoyez le saignement avec de la gaze de coton carrée stérilisée.
   3. Pincez doucement le DRG cible avec les électrodes et appliquez 5 impulsions électriques carrées avec le système d’électroporation.
   4. Fermez les couches musculaires et cutanées avec des sutures en nylon 5-0, respectivement.
   5. Placez la souris sur une couverture chauffante (35,0 °C) sous une attention particulière jusqu’à ce qu’elle ait complètement repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Remettez la souris dans la cage domestique une fois qu’elle s’est complètement remise de l’anesthésie.
      REMARQUE : Il faut environ 60 minutes pour que la souris se remette complètement de l’anesthésie sur la couverture à 37 °C. Dissoudre un comprimé (200 mg) d’ibuprofène dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) pour l’alimentation quotidienne afin de soulager la douleur post-chirurgicale.
3. Sciatic Nerve Crush
   1. Deux ou trois jours (selon le plan expérimental) après l’électroporation DRG, anesthésier la souris par voie intrapéritonéale avec la solution anesthésique (avec avertin 400 mg/kg de poids corporel).
   2. Collez les quatre membres de la souris sur le tableau en liège.
   3. Faites une incision de 1 cm à 0,5 cm sur le côté gauche le long de la ligne médiane. Coupez les muscles, tels que le muscle grand fessier et le muscle piriforme, longitudinalement. Exposez le segment du nerf sciatique entre le grand foramen sciatique et l’encoche sciatique.
   4. Écrasez le nerf avec une pince de microchirurgie pendant 12 secondes et marquez le site d’écrasement avec une suture épineurale en nylon 10-0. Faites un nœud sur la membrane durale pour marquer le site d’écrasement.
   5. Fermez les couches musculaires et cutanées avec une suture en nylon 5-0.
   6. Placez la souris sur une couverture chauffante (35,0 °C) avec une attention particulière jusqu’à ce qu’elle ait complètement repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Remettez la souris dans la cage d’accueil une fois qu’elle s’est complètement rétablie de l’anesthésie.
      REMARQUE : Il faut environ 60 minutes pour que la souris se remette complètement de l’anesthésie sur la couverture à 37 °C. Dissoudre un comprimé (200 mg) d’ibuprofène dans 1 000 ml d’eau (0,2 mg/ml) pour l’alimentation quotidienne afin de soulager la douleur post-chirurgicale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ECM 830 Système d’électroporation à ondes carrées	BTX Harvard Apparatus	45-0052	Pour l’électroporation in vivo
Pinces à épiler électrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0524	Pour l’électroporation in vivo, 1 mm plat
Picospritzer III	Parker Instrumentation	1096	Systèmes de distribution de micro-injection intracellulaire
Capillaires en verre borosilicaté	World Precision Instruments, Inc.
Microscope à stéréo-dissection	Leica	M80
Pince de microchirurgie	FST de DUMONT, Suisse	11255-20	Uniquement pour l’écrasement du nerf sciatique
Glass Capillary	World Precision Instruments, Inc.	TW100-4	10 cm, ruban adhésif standard
	Fisherbrand	15-901-30	Pour fixer la souris sur le tableau en liège
2, 2, 2-Tribromoéthanol (Avertin)	Sigma-Aldrich	T48402	Avertin solution mère
2-méthyl-2-butanol	Sigma-Aldrich	152463	Avertin solution mère
siRNA Fluorescent Universal Negative Control #1	Sigma-Aldrich	SIC003	SiARN non cible avec
microARN à fluorescence Contrôle de la transfection mimique avec Dy547	Dharmacon	CP-004500-01-05	MicroARN non cible à fluorescence
Kit de préparation de plasmides	Invitrogen Purelink	K210016	Préparation de plasmide codant pour GFP
Colorant vert rapide	Millipore-Sigma	F7252	Pour une meilleure visualisation du contour du DRG pendant l’injection
Kétamine	Putney, Inc	NDC 26637-731-51	Induction de l’anesthésie
Xylazine	AnaSed	NDC 59399-110-20	Induction de l’anesthésie
Acétaminophène	McNeil Consumer Healthcare	NDC 50580-449-36	Soulagement de la douleur post-chirurgicale

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