Quantification des épines dendritiques à l’aide de l’imagerie par microscopie confocale

Résumé

Source : Gouder, et. al. Quantification tridimensionnelle des épines dendritiques des neurones pyramidaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. J. Vis. Exp. (2015).

Cette vidéo démontre l’imagerie et l’analyse des épines dendritiques dans des neurones pyramidaux transduits et immunomarqués à l’aide de la microscopie confocale. Le bruit de fond est réduit et les dendrites sont tracées en estimant leur diamètre et leur longueur. La segmentation automatisée de la colonne vertébrale implique la définition de paramètres pour les dimensions de la dendrite et de la colonne vertébrale et la classification des épines. Un modèle 3D est généré et exporté pour analyse.

Protocole

1. Culture neuronale

1. Traitez les plaques de culture à 6 puits avec des lamelles en verre avec de la poly-ornithine (diluée à 1/6 dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), concentration de stock 0,01 %) pendant la nuit (O/N), suivie de trois lavages dans DPBS. Ensuite, ajoutez de la laminine (concentration de base 1 mg/ml, diluée 500 fois dans du DPBS) pendant au moins 10 heures sous la hotte d’écoulement.
2. Plaquer et expédier des cellules souches neurales (NSC) à faible densité (50 000 cellules/cm2) dans des plaques de culture à 6 puits avec lamelles en verre dans 3 ml de milieu de culture composé d’un mélange de milieux et de nutriments modifiés Eagle de Dulbecco F-12 ou DMEM/F12 (500 ml), de 2 flacons (5 ml chacun) de supplément N2, de 2 flacons (10 ml chacun) de supplément B27, 10 ml de Pen-Streptomycine (Pénicilline = 10 000 unités/ml et Streptomycine = 10 000 unités/ml), 1 ml de 2-mercaptoéthanol (Solution mère : 50 mM) et de laminine (1/500), sans facteurs de croissance.
   ÉTAPE CRITIQUE : Effectuez cette étape avec précaution en ajoutant des cellules avec des mouvements de rotation lents pour réduire l’agrégation cellulaire.
3. Retirez le milieu de culture. Ajouter un milieu N2B27 frais contenant 2 μg/ml de solution de laminine fraîche pour maintenir le neurone attaché sur les lamelles en verre et éviter l’agglutination. Changez de support tous les 3 jours. Conservez une partie du milieu restant (200 μl) avant d’ajouter du milieu frais afin d’éviter que la cellule ne sèche. Vous pouvez également procéder rapidement et modifier le volume total (3 ml).

2. Remarque sur la transduction lentivirale

: L’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est déterminée par le promoteur de la phosphoglycérate kinase de souris (PGK). Pour cette étude, le titre viral était de 400 ng/μl (solution mère dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x).

1. Transduisez des cellules souches pluripotentes induites humaines ou des neurones dérivés d’iPSC à n’importe quelle étape de la maturation par des particules virales en ajoutant 1 μl de la solution mère contenant 40 ng de vecteur lentiviral GFP par puits de culture (plaques à 6 puits) et incubez pendant 48 heures dans un milieu de culture frais. Remarque : Pour ce protocole, la durée d’incubation permet un bon étiquetage des structures de la colonne vertébrale.

3. Note d’immunofluorescence

: Afin d’améliorer le marquage de l’ensemble de la morphologie de la colonne vertébrale, le marquage par immunofluorescence a été effectué à l’aide d’un anticorps anti-GFP dans des conditions perméabilisées.

1. Retirer le milieu de culture et fixer les cellules transduites sur des lamelles de suspension dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 min à température ambiante ou RT, puis laver 3 fois dans 1x PBS (10 min chacune).
2. Immergez les lamelles dans du PBS complété par 0,05 % de Triton (100x) et 10 % de sérum de cheval pendant 1 heure à RT, puis lavez 3 fois dans 1x PBS.
3. Ajouter 100 μl de 1x PBS complété par 4 % de sérum de cheval et d’anticorps primaire (1/1 000) élevé contre la GFP et dilué par un facteur de 1 000 sur chaque lamelle. Incuber dans une boîte sombre O/N à 4°C, puis laver 3 fois avec 1x PBS.
4. Diluer l’anticorps conjugué à Alexa Fluor 488 (1/200) dans du PBS complété par 0,5 % de Tween 20 et incuber pendant 1 heure à RT. Ensuite, laver 3 fois dans 1x PBS et monter les lamelles sur des lames de verre avec un milieu de montage pour la microscopie à fluorescence.

4. Imagerie dendritique de la colonne

vertébrale

1. Effectuez une imagerie confocale à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.
2. Sélectionnez des neurones sains avec une morphologie pyramidale et une arborisation dendritique complète, et quantifiez au moins 10 neurones par condition à partir d’expériences distinctes. Quantifier 60 à 100 μm par dendrite.
3. Acquérez des images à l’aide d’un objectif 40X oil NA = 1,3 et d’une ligne laser de 488 nm pour l’excitation GFP, avec une puissance de crête typique au niveau de l’échantillon d’environ 20 μW. Réglez la taille des pixels autour de 80 nm pour échantillonner correctement les épines dendritiques.
   Remarque : L’analyse ultérieure nécessite une image dans laquelle le bruit ne compromet pas la bonne segmentation des dendrites et des épines. Avec les paramètres d’échantillonnage spatial et de puissance mentionnés ci-dessus, nous avons observé qu’un temps de séjour des pixels de 3,15 μs est suffisant pour collecter suffisamment de photons pour construire une telle image. Pour les échantillons sombres, la qualité de l’image peut être améliorée en faisant la moyenne de 2 à 4 balayages. L’acquisition de plusieurs tuiles XY peut être nécessaire pour couvrir la région d’intérêt, qui doit ensuite être cousue avant d’être traitée.
4. Pour échantillonner l’ensemble du volume neuronal, acquérez une pile Z avec un espacement Z allant de 150 nm à 300 nm, ce qui donne 20 à 30 tranches Z.
   Remarque : La résolution spatiale latérale obtenue avec ces paramètres est de 234 nm et la résolution axiale est de 591 nm. L’échantillonnage choisi ici est adéquat, mais comme la résolution axiale est supérieure à la plus petite taille des épines à imager, l’analyse privilégie les épines qui s’étendent latéralement à partir des dendrites.

5. 3D Quantification des épines dendritiques

Remarque : Les sections suivantes décrivent spécifiquement l’utilisation du logiciel Imaris pour l’analyse. D’autres implémentations existent, notamment NeuronStudio ou Metamorph, qui peuvent fournir des résultats similaires.

Utilisez les paramètres clés suivants :

1. En tant qu’étape de prétraitement, le filtrage gaussien est utilisé via les fonctions de traitement d’image offertes par le logiciel. Effectuez un filtrage gaussien via le traitement d’image > le lissage > filtre gaussien. Définissez la largeur du filtre pour qu’elle soit égale à la taille du pixel en XY.
2. Effectuez un traçage semi-automatique des dendrites à l’aide du module Filament Tracer du logiciel.
   1. Tout d’abord, estimez le diamètre de la dendrite à l’aide de l’outil de distance dans l’onglet Tranche du logiciel.
   2. Dans l’onglet Surpass, cliquez sur l’outil Filaments. Pour une meilleure robustesse, ce protocole s’appuie sur un suivi semi-automatisé ; cliquez sur Skip automatic creation. L’interface du module affiche maintenant l’onglet Dessiner. Ici, sélectionnez AutoPath comme méthode, Dendrite comme type, puis entrez le diamètre estimé de la dendrite.
   3. Utilisez le mode Sélection du pointeur, en transformant le curseur en boîte. Shift-clic droit sur le point de départ de la dendrite. Remarque : Le logiciel effectue les premiers calculs.
   4. Déplacez le pointeur le long de la dendrite. À partir du point de départ (représenté par une sphère bleue), une ligne jaune représentant le chemin de dendrite le plus probable est affichée. Maintenez la touche Maj enfoncée et cliquez avec le bouton gauche sur l’extrémité de la dendrite.
3. Effectuez la segmentation automatisée des épines. Remarque : Les épines de la dendrite tracée doivent être trouvées automatiquement par l’interface du module.
   1. Dans l’interface du module, cliquez sur l’onglet Création. Dans la liste déroulante Reconstruire, choisissez Reconstruire le diamètre de la dendrite et cochez la case Conserver les données. Cliquez ensuite sur Reconstruire.
   2. Définissez le seuil de sorte que le volume segmenté corresponde au volume de dendrites réel. En tant qu’algorithme, sélectionnez la distance la plus courte sur la carte des distances. Cliquez sur le bouton Suivant.
   3. Déterminez le plus petit diamètre de tête dorsale et la longueur maximale, toujours à l’aide de l’outil de distance dans l’onglet Tranche du logiciel, puis revenez à l’onglet Surpasser et entrez les paramètres. Pour ce protocole, des valeurs autour de 200 - 300 nm pour un diamètre minimal et 4 μm pour une longueur maximale sont de bons points de départ. Ne cochez pas la case Autoriser les épines de branche. Cliquez sur le bouton Suivant.
   4. Ajustez le seuil de points de départ de sorte que les points bleus représentant les épines se localisent sur les têtes de colonne vertébrale réelles. Cliquez sur le bouton Suivant. Remarque : Le calcul de base est maintenant terminé et peut être long.
4. Classifiez les épines en allant dans l’onglet Outils de l’interface du module. Cliquez sur Classifier les épines. Dans l’interface utilisateur qui s’affiche, assurez-vous qu’il existe quatre classes, définies par leur morphologie comme suit : Stubby : longueur <1 μm ; Champignon : Longueur (colonne vertébrale) >3 et largeur maximale (tête) >largeur moyenne (cou) x 2 ; Long mince : Largeur moyenne (tête) ≥ Largeur moyenne (cou) ; Filopodia-like : Longueur ≤ 4 μm (sans tête). Remarque : L’interface du module génère quatre nouveaux objets Filament contenant les résultats de la classification.
5. Exporter les données statistiques : sur l’une de ces quatre interfaces d’objet, allez dans l’onglet Statistiques. Cliquez sur le bouton Exporter toutes les statistiques dans un fichier.
   Remarque : D’autres valeurs statistiques peuvent être exportées pour les dendrites (par exemple, la longueur, la surface, le diamètre moyen, la profondeur de la branche, l’angle de branchement, le volume, etc.) et les épines (par exemple, la rectitude, la zone d’attache, la longueur et le volume des parties distinctes de la colonne vertébrale, diamètre de la colonne vertébrale, densités, etc.).

Matériaux