Isolement et culture des cellules souches neurales Crête des follicules pileux humains

Résumé

Cet article présente un protocole robuste pour l'isolement et la culture des cellules souches neurales de crête des follicules pileux humains.

Résumé

Les follicules pileux subissent une croissance continue et le cycle de cheveux est un processus bien contrôlé impliquant la prolifération des cellules souches et la quiétude. Renflement de cheveux est un créneau bien caractérisé pour les cellules souches adultes ^1. Ce segment de la gaine épithéliale externe contient un certain nombre de différents types de cellules souches, notamment les cellules souches épithéliales ^2, les cellules souches de mélanocytes ³ ​​et crête neurale comme les cellules souches ^4-7. Les follicules pileux sont une source accessible et riche pour les différents types de cellules souches humaines. Nous et d'autres avons isolé des cellules souches neurales de crête (SNCLC) de follicules pileux humains fœtaux et adultes ^4,5. Ces cellules souches humaines sont des cellules de retenue de l'étiquette et qui sont capables de s'auto-renouveler par division cellulaire asymétrique in vitro. Ils expriment des marqueurs de cellules neurales immatures mais pas de crête marqueurs de différenciation. Notre étude a montré que le profil d'expression qu'ils partagent le même profil d'expression génique similaire avec murin peau immature création de neuronescellules st. Ils présentent multipotence clonale qui peuvent donner lieu à des lignées de cellules myogéniques, mélanocytaire et neuronale après in vitro de culture cellulaire clonale unique. Les cellules différenciées non seulement acquérir la lignée des marqueurs spécifiques, mais aussi la démonstration de fonctions appropriées dans des conditions ex vivo. En outre, ces SNCLC montrer le potentiel de différenciation vers lignées mésenchymateuses. Différenciées des cellules neuronales peuvent persister dans le cerveau de souris et de conserver les marqueurs de différenciation neuronale. Il a été montré que les dérivés SNCLC follicule pileux peut aider à la repousse nerveuse, et ils améliorent la fonction motrice chez les souris transplantées avec des cellules souches à la suite de ces lésions de la moelle épinière sectionnant ^8. En outre, les nerfs périphériques ont été réparés avec des greffes de cellules souches ^9, et l'implantation de cellules précurseurs provenant de la peau adjacente à écraser les nerfs sciatiques a abouti à la remyélinisation ^10. Par conséquent, les follicules pileux de la peau / SNCLC dérivés ont déjà montré des résultats prometteurs pour rthérapie egenerative dans des modèles précliniques.

Reprogrammation de cellules somatiques à des souches pluripotentes (iPS) a montré un énorme potentiel pour la médecine régénérative. Cependant, il ya encore beaucoup de problèmes avec les cellules iPS, en particulier l'effet à long terme de l'oncogène / virus intégration et tumorigénicité potentielle de cellules souches pluripotentes n'ont pas été traitées de manière adéquate. Il existe encore de nombreux obstacles à surmonter avant que les cellules iPS peuvent être utilisés pour la médecine régénérative. Alors que les cellules souches adultes sont connus pour être en sécurité et ils ont été utilisés en clinique depuis de nombreuses années, comme la greffe de moelle osseuse. Beaucoup de patients ont déjà bénéficié de ce traitement. Autologues de cellules souches adultes sont toujours les cellules préférées pour la transplantation. Par conséquent, les cellules facilement accessibles et extensible souches adultes dans la peau de l'homme / les follicules pileux sont une source précieuse pour la médecine régénérative.

Protocole

1. Préparation des plaques de culture tissulaire

1. Manteau chaque puits avec suffisamment de Poly-D-Lysine (PDL) pour couvrir le fond du puits. Laisser les plaques à sécher dans la hotte.
2. Après les puits sont à sec, rincez avec de l'eau stérile et aspirer. Laisser les plaques à sécher dans la hotte.
3. Une fois sec, le manteau avec de la fibronectine (qui a été dissous dans de l'eau Biowhittaker une nuit à 37 ° C, à une concentration de 1 mg dans 6 ml).
4. Ajouter à moyen NCSC [95 ml DMEM/F12, 1 ml Penn / Strep (P / S), 1 ml N2, 2 ml B27, 100 ul mercaptoéthanol (2ME, 50 mm stock), le bFGF (20 ng / ml de milieu), l'IGF -1 (20 ng / ml d....

Discussion

Les méthodes d'isolement et de culture de cellules décrites sont reproductibles et robuste. Nous avons généré SNCLC parmi des dizaines de personnes à travers une large tranche d'âge. Bien qu'il soit préférable de traiter le tissu juste après la récolte des tissus, nous avons constaté que les tissus du cuir chevelu peuvent être stockés en toute sécurité dans les médias sur la glace pour le transport du jour au lendemain avec un impact minimal sur la viabilité cellulaire.

Il est im.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Invitrogen	11965-092
DMEM/F12	Invitrogen	11330-32
Sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur	Hyclone	SH30071.03
supplément B27	Invitrogen	17504044
supplément N2	Invitrogen	17502048
bFGF	Invitrogen	PHG0026
EGF	R&système R&D	236-EG-01M
IGF-I	R&système R&D	291-G1-050
0,05 % de trypsine/EDTA	Invitrogen	25300-054
Dispase	Invitrogen	17105041
Pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15070063
Tableau 1.