Article de méthode

Préparation de Synaptoneurosomes de Mouse Cortex en utilisant un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose

DOI :

10.3791/3196

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17 septembre 2011

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin, 2Department of Biochemistry, Waisman Center for Developmental Disabilities, University of Wisconsin

Dans cet article

Résumé

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Une méthode pour préparer translation active, synaptoneurosomes intacte (SNS) de la souris cortex cérébral est décrite. La méthode utilise un gradient de densité discontinu de Percoll-sucrose permettant la préparation rapide de SNS active.

Résumé

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Synaptoneurosomes (SNS) sont obtenus après homogénéisation et fractionnement de cortex cérébral de la souris. Ils sont refermés vésicules ou des terminaux isolés que rompre avec terminaisons axonales lorsque le tissu cortical est homogénéisé. Le SNS conserver des caractéristiques pré-et post-synaptiques, ce qui les rend utiles dans l'étude de la transmission synaptique. Ils conservent la machinerie moléculaire utilisée dans la signalisation neuronale et sont capables d'absorption, le stockage et la libération de neurotransmetteurs.

La production et l'isolement de SNS active peut être problématique médias utilisant comme Ficoll, qui peuvent être cytotoxiques et nécessitent une centrifugation prolongée due à haute densité, et la filtration et des méthodes de centrifugation, ce qui peut entraîner une faible activité en raison de dommages mécaniques de la SNS. Cependant, l'utilisation des gradients de densité discontinu de Percoll-sucrose pour isoler SN fournit une méthode rapide pour produire de bons rendements de SNS translation active. La méthode du gradient Percoll-sucrose est rapide et en douceur car il emploie des conditions isotoniques, a fait tourner la centrifugation moins nombreux et plus courts et évite les étapes de centrifugation que les SRS granulés et causer des dommages mécaniques.

Protocole

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1. Les préparatifs 1-4

  1. Préparer tampon de 500 mL de milieu de gradient (GM) en mélangeant 50 ml d'une suspension de 2,5 M de saccharose, 2,5 mL d'un 1M Tris-HCl, pH 7,5 stock, et 0,1 mL d'une EDTA 0,5 M, pH 8,0 milli-actions avec Q eau au volume. Filtre stériliser la solution, et de stocker aliquot congelé.
  2. Préparer un stock de 1000x de tétrodotoxine (TTX) en faisant une solution à 1 mM dans milli-Q H 2 O. Des aliquotes de TTX peuvent être stockés à -20 ° C.
  3. Préparer tampon de stimulation 10x en faisant une solution de Tris 100 mM (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM de KH 2 PO 4,

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Discussion

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La préparation gradient discontinu de Percoll-sucrose décrite ici est une méthode rapide et fiable d'isoler actifs SN, qui peut être utilisé dans une variété d'expériences de la transmission synaptique. Cette méthode de gradient, qui est basé sur la méthode développée par Dunkley et al., 3,4 est une procédure cerveau subcellulaire fractionnement qui isole à la fois pré-et post-synaptiques à la membrane des vésicules dérivées qui sont associés à un autre. Sans autre purification de ces SNS sont compati.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Nous tenons à remercier BK août de l'Université de Wisconsin-Madison Facilité microscope électronique pour la microscopie électronique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01-DA026067 et P30-HD03352 (pour la JSM).

....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Société Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Kit Micro BCA Protein Assay Pierce 23235
CaCl 2 Fisher C79-500
Gaz CO 2 Airgas (UW-MDS) CD 50
EDTA RPI E57020
EtOH Fisher A407SK-4
HCl Fisher A142-212
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
KH 2 PO 4 Fisher P285-500
PierceSDS-PAGE de préparation d'échantillons Kit Pierce 89888
NaCl RPI S23020
NaHCO 3 Fisher BP328-500
Na 2 PHO 4 Fisher S381-500
Saccharose RPI S24060
Tris Base RPI T60040
Tetrodotoxine Sigma T5651
Express Pro label Mix S35 Tag Facile Perkin Elmer NEG772
Équipement Société Numéro de catalogue Commentaires (optionnel)
Des outils de dissection
Dounce homogénéisateur, 7 ml (livré avec deux pilons en verre étiqueté «A» et «B») Wheaton
P1000 Gilson Pipetman Gilson F123602
Allegra 6KR Centrifugeuse Beckman Coulter 366830
GH 3.8 Rotor, rotor swing Beckman Coulter 360581
Beckman J2-21 Centrifugeuse Beckman
Beckman tubes avec des bouchons Beckman 355672
Blanc adaptateurs fortifiée Beckman 342327
Bleu adaptateurs fortifiée Beckman
JA-17 Rotor, Rotor angulaire Beckman 369691

Table des anticorps utilisés pour Western blot:

Nom de l'anticorps Société Numéro de catalogue Espèce Hôte Facteur de dilution
β-actine Sigma A5441 la souris 1:2000
GFAP Santa Cruz sc-65343 la souris 1:200
GP73 Santa Cruz Sc-134509 lapin 1:200
HSC70 Santa Cruz SC-7298 la souris 1:200
Laminβ Santa Cruz Sc-6261 de chèvre 1:200
Prohibitin Santa Cruz sc-28259 lapin 1:200
PSD95 Millipore MAB1596 la souris 5 ug / uL
SNAP25 Abcam ab5666-100 lapin 1:2000
Synaptophysine Millipore MAB368 la souris 1:500
β-3-tubuline Santa Cruz sc-80016 la souris 1:200

Références

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  1. Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
  2. Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic pr....

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Mots-clés

Gradient Percoll sucrosecentrifugation sur gradient de densitisolement des synaptosomesanalyse par Western blotincorporation de m thionine S35tudes de la traduction prot iquecapture par les v sicules synaptiqueslib ration des neurotransmetteurs

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