Visualisation du transport intracellulaire de marchandises dans des astrocytes en culture

Résumé

Source : Creighton, B. A., et al. Visualisation et analyse du transport intracellulaire d’organites et d’autres cargaisons dans les astrocytes. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la visualisation du transport de fret intracellulaire dans des astrocytes en culture à l’aide d’une sonde acidotrope fluorescente qui marque sélectivement les vésicules endolysosomales acides. L’imagerie en accéléré et l’acquisition de la pile Z avec un microscope confocal permettent de suivre la cargaison marquée par fluorescence dans tout le volume de la cellule tridimensionnelle. L’analyse différencie le fret stationnaire du fret se déplaçant vers la périphérie cellulaire ou le noyau, fournissant des informations sur la dynamique du transport intracellulaire.

Protocole

1. Transfection de plasmides marqués par fluorescence

1. La veille de la transfection ou du marquage, ensemencez les astrocytes à la densité souhaitée pour l’imagerie 24 à 48 h après la transfection. La densité recommandée pour les plaques de 24 puits ou les puits à fond de verre de 14 mm est de 2 x 104 cellules/puits.
   REMARQUE : Ce protocole est optimisé pour la transfection d’astrocytes plaqués sur des lamelles de verre de 12 mm sur des plaques de 24 puits ou des puits à fond de verre de 14 mm à l’aide d’une méthode basée sur la lipofection. Les réactifs doivent être mis à l’échelle en fonction de la taille de la boîte de culture dans laquelle les astrocytes se développent.
2. Diluer le réactif de lipofection (Table des matériaux) dans un milieu sérique réduit (Table des matériaux). Pour optimiser le rapport entre le réactif de lipofection et l’ADN, testez une gamme de dilutions adéquates. Par exemple, si vous utilisez le réactif utilisé dans ce protocole (Table des matériaux), diluez 2, 3, 4 et 5 μL du réactif de lipofection dans 50 μL de milieu sérique réduit.
3. Diluer 5 μg d’ADN de haute pureté dans 250 μL de milieu sérique réduit. Ajouter 5 μL de réactif d’amplification de lipofection (Table des matériaux). Combinez le tube contenant le réactif de lipofection avec un volume égal de mélange d’amplificateur d’ADN et de lipofection. Mélanger par pipetage et incuber à température ambiante (RT) pendant 15 min.
4. Retirez le milieu de culture d’astrocytes et ajoutez le mélange de transfection (étape 1.3) aux cellules goutte à goutte. Après une incubation de 6 h à 37 °C et 5 % de CO2, remplacer le complexe de transfection par un volume approprié de milieu de culture d’astrocytes (2 mL pour les plats à fond de verre de 14 mm). Incuber pendant 24 à 72 h supplémentaires avant de procéder à l’acquisition de l’image. Surveiller de près la durée de l’étape d’incubation pour obtenir le meilleur équilibre entre l’expression des protéines et la viabilité cellulaire.

2. Marquage des endosomes/lysosomes tardifs à l’aide de sondes fluorescentes

REMARQUE : Certaines cargaisons peuvent être marquées à l’aide de colorants fluorescents ayant une forte affinité pour les protéines spécifiques à la cargaison. L’exemple suivant permet de marquer des endosomes/lysosomes tardifs à l’aide d’une sonde acidotrope fluorescente.

1. Diluer la sonde de marquage lysosomale (table des matériaux) dans 200 μL de milieu de culture d’astrocytes jusqu’à une concentration de travail de 1 μM et appliquer sur les astrocytes à partir de l’étape 1.1 à une densité de 2 x 104 cellules/puits. Incuber pendant 30 min à 37 °C.
2. Lavez les cellules une fois avec un milieu de culture d’astrocytes chaud et remplacez-les par un milieu d’imagerie (tableau des matériaux). Passez immédiatement à l’imagerie en direct.

3. Acquisition d’images à l’aide d’un système d’imagerie time-lapse

REMARQUE : L’imagerie en direct time-lapse doit être effectuée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une caméra à grande vitesse, d’une mise au point définie, d’une chambre d’incubation et d’un objectif à huile 40x avec une grande ouverture numérique (par exemple, Plan-Apochromat 1.4NA). Une variété de logiciels d’acquisition est disponible pour l’imagerie en accéléré. Le choix du système de microscopie et du logiciel d’acquisition doit être basé sur leur disponibilité et leur adéquation aux objectifs de l’étude particulière. Certaines directives générales sont fournies ci-dessous.

1. Placez la chambre ou la boîte de culture dans l’adaptateur approprié sur la platine du microscope. À l’aide de la lumière d’épifluorescence, sélectionnez la ou les cellules qui expriment les protéines fluorescentes ou la sonde à enregistrer. Ajustez l’éclairage de l’échantillon fluorescent pour visualiser la ou les cellules sélectionnées à l’aide de l’appareil photo numérique. Évitez d’utiliser un éclairage élevé qui pourrait provoquer un photoblanchiment et une phototoxicité. Ajustez la mise au point et le zoom.
2. Acquérez une seule série de time-lapse Z-stack à une fréquence de 1 image toutes les 2 s pour des intervalles de temps compris entre 300 s et 500 s à l’aide des fonctions zoom et mise au point définie.
   REMARQUE : La dynamique de trafic (vitesse, fréquence de mouvement, etc.) varie en fonction de la protéine d’intérêt, de sorte que le cours temporel de l’acquisition peut nécessiter un ajustement. Par exemple, les mitochondries sont moins mobiles que les lysosomes et présentent des pauses fréquentes. Dans ce cas, il est plus approprié d’ajuster les paramètres d’acquisition à 1 image toutes les 5 s pendant 800 s.
3. Enregistrez des images time-lapse et exportez-les sous forme de fichiers de pile AVI ou TIFF.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gen Clone	25-500
Fetal Bovin Serum	Gemini	100-106	Heat-Inactivated
FIJI (Fiji is Just Image J)	NIH	Version 1.52i
Pince à épiler à pointe fine	F.S.T	11254-20	Style #5
Source lumineuse à fluorescence	Excelitas	012-63000	X-Cite 120Q
Plats à fond en verre	Mattek corporation	P35G-1.5-14-C	Plat 35 mm | N° 1.5 Recouvrement | Diamètre du verre de 14 mm |
Pince Graefe non	F.S.T	11054-10	Pince à iris Graefe à pointes incurvées
Colorant fluorescent vert qui colore les compartiments acides (endosomes tardifs et lysosomes)	Life Technologies	L7526	LysoTracker Vert DND 26. Pré-dissous dans du DMSOS dans une solution mère de 1 mM. Diluer jusqu’à la concentration de travail finale dans le milieu de culture ou le tampon de votre choix.
Solution saline équilibrée de Hank (10x)	Gibco	14065-056	Sans magnésium ni calcium
Supports d’imagerie Life	Technologies	A14291DJ	Live Cell Imaging Solution
Microscope confocal inversé	Zeiss		LSM 780
KymoToolBox			https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox
Lipofection Enhancer Reagent	Life Technologies	11514015	Plus Réactif
Lipofection Reactif	Life Technologies	15338100	Lipofectamine LTX Incubateur
à agitation orbitale	New Brunswick Scientific	8261-30-1008	Innova 4230 , incubateur à agitation orbitale avec contrôle de la température et de la vitesse
Solution de pénicilline/strépomycine (100x)	Gen Clone	25-512
Saline tamponnée au phosphate (10x)	Gen Clone	25-507x
Poly-D-Lysine Hydrobromide	Sigma	P7405	Dissoudre dans un tampon Tris, pH 8,5, à 1mg/mL. Congeler pour un stockage à long terme. Éviter les cycles de congélation et de décongélation
Milieu sérique réduit	Gibco	31985-062	OPTI-MEM
Flacons de culture tissulaire	Olympus Plastics	25-209	75 cm^2. Accès au col incliné à 100 %, capuchon filtrant ventilé hydrophobe de 0,22 um
Incubateur de culture tissulaire	Thermo Scientific	51030285	HERAcell VIOS 160i, incubateur de culture tissulaire avec contrôle de
la température, de l’humidité et du CO2Tris-Base	Sigma	T1503	8.402 g dissous dans un litre dans l’eau avec 4.829 g Tris HCl pour faire 0,1 M tampon Tris, pH 8.5
Tris-HCl	Sigma	T3253	4.829 g dissous dans un litre dans l’eau avec 8.402 g Tris Base pour faire 0,1 M tampon Tris, pH 8.5

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