Imagerie confocale tridimensionnelle à haute résolution de la barrière hémato-encéphalique dans une section de cerveau de souris

Résumé

Source : Villaseñor, R et Collin. L. Imagerie confocale à haute résolution de la barrière hémato-encéphalique : imagerie, reconstruction 3D et quantification de la transcytose. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo fait la démonstration d’une imagerie 3D haute résolution de la barrière hémato-encéphalique (BHE) à l’aide de la microscopie confocale, montrant des coupes de cerveau de souris colorées par des anticorps pour analyser les composants de la BHE et les structures intracellulaires, applicable à l’étude de l’homéostasie cérébrale, des interactions neurovasculaires et du dysfonctionnement de la BHE lié à la maladie.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Imagerie confocale haute résolution de la barrière hémato-encéphalique
2. Effectuez l’acquisition d’images avec un microscope confocal à balayage laser approprié (voir le tableau des matériaux) avec des lignes laser à 405, 488, 561 et 633 nm pour l’excitation des fluorophores dans les régions bleues, vertes, oranges et rouges du spectre lumineux. Pour l’acquisition d’images, utilisez un objectif à huile 63X avec une ouverture numérique de 1,4.
3. Dans le menu d’acquisition du logiciel qui contrôle le microscope, réglez les paramètres d’acquisition d’image. Dans le menu déroulant « Taille de l’image », sélectionnez une valeur de 1024 x 1024 pixels. Modifiez la taille des pixels à une valeur comprise entre 200 et 300 nm en ajustant la valeur du menu 'Zoom'."
   REMARQUE : Pour l’analyse des structures intracellulaires, réduisez la taille des pixels à 75 nm. Ce paramètre de taille d’image augmente considérablement le temps d’acquisition et peut être réduit à 512 x 512 pixels pour réduire le temps d’acquisition en imageant un champ de vision plus petit.
4. Dans le menu déroulant 'Vitesse d’acquisition', sélectionnez une valeur de 400 Hz, c’est-à-dire 400 lignes par seconde. Dans le menu « Paramètres système », sélectionnez le menu déroulant « Profondeur de pixels » et changez la valeur en 12 bits.
5. Dans le logiciel du microscope, dans l’onglet « acquisition », activez l’option d’acquisition séquentielle de l’image. Réglez l’épaisseur de la section optique sur une valeur comprise entre 0,75 et 1 μm pour chaque canal en modifiant la valeur dans le menu 'Sténopé'.
6. Dans le panneau d’excitation fluorescente, activez le laser nécessaire pour exciter de manière optimale les fluorophores de l’échantillon, par exemple, une ligne laser de 488 nm pour un fluorophore émettant vert.
   REMARQUE : Utilisez un visualiseur de spectres de fluorophores (voir Tableau des matériaux) pour sélectionner le laser d’excitation adéquat.
7. Dans le panneau de détection fluorescente, déplacez le curseur pour sélectionner les longueurs d’onde qui seront mesurées dans chaque canal, par exemple, entre 510 et 550 nm pour un fluorophore émettant vert.
   REMARQUE : Utilisez un visualiseur de spectres de fluorophore (voir Tableau des matériaux) pour sélectionner les longueurs d’onde de détection adéquates.
8. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion avec un indice de réfraction de 1,52 sur la lamelle avec la section du cerveau pour correspondre à l’indice de réfraction de la lamelle en verre et de l’objectif. Placez l’échantillon dans le microscope et allumez la lampe épifluorescente pour visualiser l’échantillon à l’aide des jumelles du microscope.
9. À l’aide des boutons situés sur le support du microscope, changez la roue à filtres pour sélectionner un filtre approprié pour la visualisation des noyaux colorés au DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole). Utilisez la mise au point grossière pour mettre au point le signal des noyaux colorés au DAPI.
10. À l’aide des boutons situés sur le support du microscope, changez de filtre pour visualiser le signal des marqueurs vasculaires (par exemple, CollagenIV ou CD31) et centrez le champ de vision sur un segment capillaire individuel.
11. Appuyez sur le bouton pour démarrer le mode de balayage en direct. Pendant le balayage, ajustez le gain et l’intensité laser pour chaque canal afin d’optimiser la plage dynamique des images et d’éviter la saturation des pixels.
    REMARQUE : Utilisez une table de recherche qui étiquette les pixels saturés pour évaluer visuellement la sursaturation. Pour éviter la sursaturation du signal, ajustez les paramètres avec l’échantillon qui doit avoir le signal fluorescent le plus élevé.
12. Définissez la valeur de la moyenne de ligne sur 2,
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez des vitesses d’acquisition plus élevées, augmentez cette valeur pour réduire le bruit.
13. Établissez des sections de début et de fin pour effectuer des empilements z optiques qui couvrent tout le volume du capillaire. Utilisez une taille de pas de 0,45 μm.
    REMARQUE : Si des images doivent être utilisées pour la quantification ultérieure, conservez les mêmes paramètres d’acquisition pour l’ensemble complet des données.
14. Pour la quantification, acquérez 10 à 20 piles z par section à partir d’au moins trois souris différentes pour des comparaisons statistiques.
    REMARQUE : Acquérez l’ensemble complet des données au cours de la même session afin de réduire la variabilité résultant du blanchiment des échantillons et des fluctuations de l’intensité laser.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
d’anticorps monoclonal de rat ER-MP12 contre CD31/PECAM	Novus Biologicals	MCA2388	Labels Cellules endothéliales cérébralesUtilisation à la dilution 1:100détecter avec un IgG anti-rat polyclonal d’âne (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400
Anticorps monoclonal de rat contre Podocalyxin	Systèmes de R&D	MAB1556	Labels Lumière des capillairesUtilisation à la dilution 1:100détecter avec un âne polyclonal anti-rat IgG (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400
Anticorps polyclonal de lapin contre le collagène	Biotrend	BT21-5014-70	Étiquettes Membrane basale des capillairesUtilisation à la dilution 1:100détecter avec l’âne polyclonal les IgG anti-lapin (H+L) couplées à l’Alexa appropriéColorant Fluor, utilisé à la dilution 1:400
Anticorps polyclonal de chèvre contre CD13	Systèmes de R&D	AF2335	Étiquettes péricytesUtiliser à la dilution 1:100détecter avec l’âne polyclonal les IgG anti-chèvre (H+L) couplés à l’Alexa appropriéColorant fluor, utilisé à la dilution 1:400
Clone d’anticorps monoclonal de souris G-A-5 contre GFAP couplé à Cy3	Abcam	ab49874	Marqueurs AstrocytesUtilisation à la dilution 1:100
Anticorps polyclonal de lapin contre Iba-1	Wako	019-19741	Marqueurs MicroglieUtilisation à la dilution 1:100détecter avec un IgG polyclonal anti-rat d’âne (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400
Anticorps monoclonal de rat ABL93 gainst LAMP2	Fitzgerald	10R-CD107BBMSP	LysosomesUtilisation à la dilution 1:100détecter avec l’âne polyclonal anti-rat IgG (H+L) couplé à un colorant AlexaFluor approprié, utilisé à la dilution 1:400
Anticorps polyclonal de l’âne contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor594	LifeTechnologies	A21203	Utilisation à la dilution 1:400
Anticorps polyclonal de l’âne contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor488	LifeTechnologies	A21202	Utilisation à la dilution 1:400
Anticorps polyclonal de chèvre contre les IgG de souris (H+L) AlexaFluor555	LifeTechnologies	A21422	Utilisation à la dilution 1:400
Fluorescent Medium de montage	Dako	S3023	Dako Support de montage fluorescent
Laser Scanning Microscope confocal	Leica Microsystems	NA	Leica TCS SP8 X avec détecteurs HyD et laser à lumière blanche
Logiciel de traitement d’images	Leica Microsystems	NA	Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587
Logiciel d’analyse d’images	Logiciel scientifique Bitplane	NA	Imaris version 7.6.5 build 31770 pour x64
Fluorescence SpectraViewer	ThermoFisher Scientific	NA	https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

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