Une technique de spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier pour étudier l’auto-assemblage des peptides

Résumé

Source : Neves, R., et al. Synthèse et caractérisation des peptides auto-assemblés modifiés au 1,2-dithiolane. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’auto-assemblage de peptides amyloïdes en une structure supramoléculaire riche en feuillets bêta à l’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier. Un faisceau infrarouge traverse un cristal à indice de réfraction élevé, et l’absorption d’énergie à travers l’interface du cristal et de l’échantillon est enregistrée. Les structures secondaires des protéines de l’échantillon sont identifiées en analysant leurs pics d’absorption caractéristiques dans des régions spécifiques du spectre infrarouge, ce qui aide à identifier la formation de l’assemblage supramoléculaire.

Protocole

1. Caractérisation des structures d’auto-assemblage supramoléculaires

1. Formation des fibres amyloïdes
   1. Pour préparer une solution à assembler soi-même, pesez 1 mg de poudre de peptide à l’aide d’une balance analytique. Dissoudre dans un mélange (pH 7,5) de 20 % d’acétonitrile et de 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES) dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL, jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL de mélange peptidique. Vortex la solution d’assemblage et laissez-la s’assembler à température ambiante.
2. Caractérisation spectroscopique des fibres amyloïdes
   1. Suivez le processus d’assemblage des peptides via la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) tous les quelques jours. Un large pic centré autour de 1670 ^cm-1 est la signature IR résultant de peptides non assemblés dans l’échantillon. Les échantillons d’assemblage peptidique prennent généralement une à deux semaines pour que le large pic non assemblé disparaisse et atteigne sa maturité.
      1. Sécher une aliquote de 8 à 10 μL de la solution d’assemblage sous forme de film mince sur le cristal de diamant ATR. Surveiller la disparition d’un grand et large pic d’eau de 1640 à 1630 ^cm-1 au fur et à mesure de la formation du film sec.
      2. Acquérez des spectres IR de 1500 à 1800 ^cm-1 en effectuant en moyenne 50 balayages avec une résolution de 2 ^cm-1. Acquérez et soustrayez les balayages d’arrière-plan avant chaque balayage d’échantillon. La signature IR pour l’assemblage de β feuilles est un pic aigu entre 1625 et 1635 ^cm-1 (Figure 1A).

Résultats

Graphique 1. Caractérisation supramoléculaire du peptide modifié au 1,2-dithiolane. (A) FT-IR de 1 mg/mL de fibres de 1,2-dithiolane-KLVFFAQ-NH₂ assemblées dans 10mM HEPES, pH 7,5 dans 20 % CH₃CN. Le pic à 1627 ^cm-1 est coh...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétonitrile	Fisher Scientific	A998-4	Inflammable ; irritant pour les yeux ; Utiliser de l’équipement de protection individuelle ; Utiliser uniquement sous une hotte ; tenir à l’écart des flammes nues ou des surfaces chaudes ; en cas de contact, rincer à l’eau pendant au moins 15 minutes et obtenir des soins médicaux
Acide 4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique	Acros Organics	AC172571000	Ne pas inhaler ; utiliser à l’extérieur ou dans un endroit bien ventilé
Spectromètre infrarouge à transformée de Fourier	Alpha Tensor, Bruker