Microinjection de cerveau de rongeur à l’aide d’une micro-aiguille de quartz

Résumé

Source : Paolone, G., et al. Aiguilles personnalisées pour les micro-injections dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre l’injection d’une micro-aiguille de cerveau de rongeur à l’aide d’une micro-aiguille de quartz trouée. La micro-aiguille est attachée à une seringue et à une micropompe pour contrôler le débit de livraison. L’aiguille contenant la solution d’injection est insérée dans le cerveau avec la vitesse de livraison réglée à faible. Une fois positionné, la vitesse de livraison est augmentée. L’aiguille est retirée après une brève pause.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des aiguilles de quartz

1. Nettoyez et stérilisez les capillaires de quartz (voir tableau des matériaux) en les plaçant pendant 5 min dans de l’eau distillée, 5 min dans de l’éthanol à 99 % et 5 min dans de l’éther diéthylique.
2. Laissez les capillaires sous le capot pendant au moins 1 h pour les laisser sécher complètement.
3. Préparez les aiguilles à l’aide d’un extracteur laser selon des paramètres qui permettent de produire une aiguille suffisamment longue et suffisamment fine, en fonction des besoins individuels.
   REMARQUE : Nous utilisons un extracteur laser (voir tableau des matériaux). Utilisez un programme à deux lignes pour tirer. La première ligne utilise une puissance élevée, la plus grande longueur de balayage (correspondant à la VALEUR DU FILAMENT) et aucune force de traction. Cette combinaison de paramètres conduit à la fusion de la plus grande partie du capillaire avec la vitesse d’extension la plus faible, ce qui permet de façonner une aiguille longue de grande taille intérieure/externe et une tige réduite. De cette façon, l’aiguille conserve une résistance mécanique élevée et un large diamètre intérieur qui permet le passage des cellules souches ou des particules virales sans colmatage. La vitesse et le retard de cette ligne de programme doivent arrêter l’extension capillaire avant que la pointe ne devienne trop petite et trop longue, manquant les caractéristiques mécaniques et de forme requises. La deuxième ligne du programme de traction est exécutée automatiquement une fois que le quartz refroidit (5 s). Les paramètres de puissance, de filament et de force de traction sont fonctionnels pour couper une pointe avec la longueur de pointe la plus courte possible et une tige raide, évitant ainsi la séparation des deux aiguilles avec une rupture de pointe. Régulièrement, avec notre équipement, nous utilisons ce qui suit : (a) Ligne 1 = puissance 990, filament 5, vitesse 130, retard 110, traction 0 ; (b) Ligne 2 = puissance 970, filament 3, vitesse 0, retard 70, traction 0.
4. Mettez les aiguilles dans une boîte de Pétri préalablement nettoyée avec de l’éthanol à 70 %.
   1. Couvrir le plat d’un film de paraffine en plastique.
5. Coupez les capillaires avec le micro-dissecteur.
   1. Au démarrage, laissez le laser exécuter un processus d’auto-étalonnage pour vérifier la puissance et l’énergie délivrées. Ensuite, réglez les paramètres de coupe.
      REMARQUE : Nous utilisons un micro-dissecteur (voir Tableau des matériaux) et les paramètres suivants : énergie d’impulsion de puissance laser (63 μJ), diamètre du faisceau laser de 20 % de l’ouverture maximale (ouverture maximale : 1,0 μm) et vitesse de coupe de 10 % de la vitesse maximale (vitesse maximale : 30 μm/s).
   2. Fixez fermement l’aiguille sur la table du microscope et placez sa pointe au centre de l’écran de l’ordinateur.
   3. Dans la barre de menu, cliquez sur l’icône du crayon et utilisez-la pour dessiner une marque pour la découpe laser de l’aiguille.
      REMARQUE : La coupe doit être à un angle d’environ 45° par rapport à la surface de l’aiguille.
   4. Sur la fonction de la barre latérale, sélectionnez le drapeau contenant le bouton « START CUT » pour permettre au laser de couper l’endroit précédemment marqué.
   5. Au besoin, percer un ou plusieurs trous latéraux en répétant les procédures décrites à l’article 1.5.2-3 ; il n’est pas nécessaire de repositionner l’aiguille (figure 1).
6. Nettoyage post-coupe.
   1. Connectez l’aiguille à une pompe à vide à travers un tube en plastique.
   2. Allumez la pompe et réglez manuellement le débit direct à une vitesse modérée (3 μL/min).
   3. Aspirez d’abord l’éthanol à 99 %, puis l’eau distillée pour éliminer les impuretés dues à la coupe.
   4. Aspirez à nouveau l’éthanol à 99 % pour faciliter le séchage.
      REMARQUE : Chaque étape doit durer au moins 3 min.
7. Conservez les aiguilles dans une boîte de Pétri correctement recouverte jusqu’au jour de l’opération.
8. Les aiguilles peuvent être réutilisées ; à la fin de l’expérience, nettoyez avec de l’eau de Javel et de l’éthanol pour éliminer la solution et les éventuels résidus de tissus. Pour un nettoyage plus complet, placez les aiguilles dans un bocal de stockage à micropipette avec la pointe pointant vers le bas, remplissez le bocal d’eau distillée jusqu’à ce que les pointes soient couvertes, faites bouillir pendant 1,5 min pour enlever tout tissu restant, puis lavez avec de l’éthanol.

2. Procédure

1. En suivant les instructions fournies dans le manuel d’utilisation de la pompe, sélectionnez le menu des paramètres pour calibrer la pompe en fonction du diamètre/volume de la seringue de micro-injection et réglez le débit à 0,3 μL/min.
2. Remplissez d’eau stérile une seringue de 10 mL munie d’une aiguille émoussée (p. ex., aiguille de Hamilton, 30 g) et d’un tube court en polytétrafluoroéthylène et utilisez-la pour remplir la seringue de micro-injection (après avoir retiré très soigneusement le piston) et le kit de pièces d’injection pour la pompe de micro-injection manuelle (MMP).
   REMARQUE : Le kit MMP sert à fixer solidement l’aiguille dans le cadre stéréotaxique (Figure 2). Le kit comprend un tube en polytétrafluoroéthylène, un coupleur luer-tube, un porte-pipette et des joints pour pipettes de différents diamètres extérieurs.
3. Connectez l’aiguille au kit MMP.
   1. Rincez plus d’eau dans le système à travers la seringue de 10 ml, et vérifiez si l’eau sort de l’aiguille.
      REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer toutes les bulles d’air à l’intérieur du système en répétant les étapes de remplissage.
4. Débranchez la seringue de 10 ml de la seringue de micro-injection tout en poussant lentement le piston afin de laisser une goutte d’eau au sommet de la seringue de micro-injection. Insérez le piston dans la seringue de micro-injection.
5. Connectez la seringue de micro-injection à la pompe et réglez le débit à 0,3 μL/min.
   REMARQUE : Attendez qu’il y ait une goutte qui s’échappe de la pointe de l’aiguille, puis laissez-la aller pendant encore 3 min.
6. Réglez le débit à 0,1 μL/min et commencez la procédure chirurgicale. La pompe doit fonctionner pendant la chirurgie.
   REMARQUE : Pour les expériences rapportées dans cet article, nous utilisons des rats Sprague Dawley mâles de 300 g (âgés de 3 mois). Cependant, la procédure est applicable à d’autres espèces, en particulier les souris.
7. Induisez une anesthésie générale à l’aide d’une méthode approuvée par les réglementations locales.
   REMARQUE : Nous utilisons un mélange d’injection intrapéritonéale (i.p.) de 85 mg/kg de kétamine et de 8 mg/kg de xylazine pendant 20 à 50 min d’anesthésie. Il est important de pincer la queue et/ou les orteils pour s’assurer que l’animal est complètement sédatif. Le niveau d’anesthésie et les signes vitaux de base sont évalués avant le début de l’opération et surveillés toutes les 10 minutes pendant l’exécution de l’opération. La température corporelle de l’animal est maintenue constante avant, pendant et après les interventions chirurgicales à l’aide d’un coussin chauffant à recirculation d’eau. Les animaux sont surveillés jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis (p. ex., ils sont debout et ambulatoires). De plus, les animaux reçoivent des analgésiques (tramadol, 5 à 7 mg/kg i.p.) en postopératoire toutes les 24 heures pendant trois jours.
   1. Rasez la tête de l’animal et préparez adéquatement le site chirurgical pour la chirurgie aseptique. Effectuez un gommage en deux étapes avec une solution à base d’iode (bétadine) suivie de 70 % d’éthanol. De plus, pour maintenir l’asepsie, enveloppez le site chirurgical avec un champ chirurgical (dans la vidéo, a été omis à des fins de démonstration).
8. Placez le rat dans le cadre stéréotaxique au-dessus d’une couverture chauffante à recirculation d’eau. Pour soulager davantage la douleur, au site de la chirurgie, appliquez une solution de lidocaïne à 0,5 % (ne pas dépasser 7 mg/kg). Pré-stérilisez tous les instruments chirurgicaux à l’aide d’un stérilisateur à billes ou d’un désinfectant à froid liquide en immergeant l’équipement dans du glutaraldéhyde à 2 % et du phénol à 7,05 % (sporodicine ou Cidex), suivi d’un rinçage à l’eau stérile ou au sérum physiologique. La désinfection doit être effectuée même entre les procédures. Faites une coupe longitudinale sur le crâne à l’aide d’un scalpel stérilisé. Soyez doux pour éviter les saignements excessifs. Ouvrez le cuir chevelu à l’aide d’une spatule plate et appliquez des clips chirurgicaux sur les lambeaux de peau pour le maintenir ouvert. Très doucement, détachez le périoste pour exposer le bregma et la zone du crâne à travers laquelle l’aiguille sera insérée.
9. Montez le bras sur le cadre stéréotaxique (pendant que le flux est en cours) et déplacez la pointe de l’aiguille exactement sur le dessus du bregma, en faisant attention à ne pas casser sa pointe. Annoter les coordonnées antéro-postérieure et médio-latérale du bregma et traduire aux coordonnées souhaitées. Guidés par un stéréomicroscope, abaissez l’aiguille jusqu’à ce que sa pointe touche presque le crâne, marquez le point de forage après avoir levé un peu le bras stéréotaxique.
10. Percez (pointe de foret Ø : 0,8 mm ; vitesse de perçage : 1 000 tr/min) le crâne à l’endroit marqué. Il faut veiller à ne pas pénétrer la dure-mère pendant les procédures de forage. Pendant le forage, versez une solution saline stérile pour éviter les lésions osseuses et la nécrose.
11. Coupez un petit morceau de film plastique de paraffine et placez-le sur le crâne. À l’aide de la pipette de 10 μL, prélever une goutte de la solution à injecter sur le film de paraffine plastique. Arrêtez la pompe, récupérez légèrement le poussoir de la pompe et créez une petite bulle d’air dans le capillaire en tirant doucement sur le piston de la seringue de micro-injection.
12. Abaissez le bras stéréotaxique jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille atteigne la goutte. Prélevez l’échantillon en tirant (très lentement) sur le piston de la seringue de micro-injection, en évitant toute formation de bulles. Replacez le poussoir de pompe en contact avec le piston et allumez la pompe à un débit de 0,3 μL/min. Attendez la formation d’une goutte (quelques minutes) avant de passer à l’étape suivante.
    REMARQUE : Dans l’exemple actuel de l’expérience, du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) a été perfusé dans le striatum [AP (antéropostérieur) : +1,5, ML (médiolatéral) : ±2,7 ; DV (dorsal) : -5,0] et dans l’hippocampe dorsal (AP : -3,5, ML : ±2,1 ; DV : -3,5 ; en mm de dura), 2 μL/site. Pour faciliter la comparaison entre les deux méthodes d’injection, chaque zone du cerveau a été perfusée à l’aide d’une aiguille de quartz dans un hémisphère et d’une aiguille émoussée de 26 G ou d’une aiguille en acier inoxydable à pointe biseautée de 30 G dans l’autre.
13. Abaissez le débit à 0,1 μL/min, entaillez la dure-mère avec une aiguille à pointe biseautée en acier inoxydable et abaissez lentement le bras stéréotaxique sur l’axe dorso-ventral, en pénétrant dans le tissu cérébral. Lorsque la position souhaitée est atteinte, descendez de 0,1 mm supplémentaire, arrêtez la pompe, soulevez le bras stéréotaxique de 0,1 mm et redémarrez la pompe à 0,3 μL/min.
    REMARQUE : La raison de maintenir un débit lent lors de l’abaissement de l’aiguille est d’assurer une pression positive qui évite la pénétration de petits fragments de tissu dans l’aiguille elle-même. Un tel événement obstruerait la pointe, ce qui nuirait à la livraison de la solution. Étant donné que le débit est très lent lors de l’abaissement de l’aiguille et que la vitesse de descente est d’environ 10 s/mm, cela implique que les quantités de solution qui restent le long de la piste de l’aiguille sont négligeables par rapport à celles injectées au site cible. Cette précaution peut être évitée lors de l’utilisation d’aiguilles avec des trous latéraux.
14. Démarrez la minuterie et attendez le temps nécessaire en fonction du volume d’injection souhaité (par exemple, 6 min 40 s si vous injectez 2 μL). Surveillez le mouvement de la bulle pendant l’injection. À la fin, arrêtez la pompe et attendez 5 minutes avant de récupérer lentement l’aiguille. Lorsque l’aiguille de quartz est complètement extraite, redémarrez la pompe et vérifiez la formation d’une goutte à la pointe de l’aiguille.
15. Scellez l’ouverture à la surface du crâne avec de la cire d’os, retirez les clips hémostatiques et suturez le cuir chevelu, enduisez la zone autour de la plaie d’une crème antibiotique (par exemple, de la néosporine) et remettez l’animal dans la cage d’origine.

Résultats

Figure 1 : Image microscopique d’une pointe d’aiguille en quartz, montrant différents diamètres de la pointe et les trous utilisés pour l’injection de fluides. Image à faible grossissement en (A) et à grossissement plus élevé en (B) ...

Matériaux