Imagerie tridimensionnelle d’astrocytes immunomarqués à l’aide de la microscopie confocale

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Animaux, chirurgie et préparations d’échantillons

REMARQUE : Préparez le tissu cérébral pour l’analyse microscopique confocale tridimensionnelle (3D).

1. Répartissez les animaux au hasard en deux groupes : bêta-amyloïde (Aβ)_1-40\u2012injection (n = 8), et Aβ_1-40\u2012injection avec traitement à la génistéine (n = 8) ; administrer la génistéine (10 mg/kg diluée dans un véhicule tel que de l’huile de ricin polyéthoxylée) par gavage 1 heure avant la chirurgie.
2. Anesthésier les animaux avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg). Confirmez la bonne anesthésie par l’absence de réflexe de retrait après avoir pincé l’orteil. Utilisez une pommade sur les yeux pendant la chirurgie pour prévenir la sécheresse.
3. Placez les animaux dans un appareil stéréotaxique et rasez la tête. Appliquez une solution iodée pour nettoyer le cuir chevelu avant l’incision et maintenez le site de l’opération stérile pendant la chirurgie afin de réduire le risque d’infection. Injecter Aβ_1-40 de manière stéréotaxique (4 μl) dans l’hippocampe à −3,5 mm en arrière du bregma, ± 2 mm latéralement à la ligne médiane et −2,8 mm en dessous de la dure-mère, selon l’atlas du cerveau du rat.
4. Fournir une observation/des soins postopératoires jusqu’à ce que les animaux soient pleinement conscients pour assurer le confort des animaux. Gardez les animaux au chaud pendant la récupération et ne les retournez pas dans une cage avec d’autres animaux jusqu’à ce qu’ils se rétablissent complètement. Faites attention à tout signe d’infection chez les animaux après la chirurgie.
5. Anesthésier profondément les animaux par de la kétamine (150 mg/kg) trois semaines après la chirurgie. Effectuer une fixation transcardique en perfusant les animaux avec 0,9 % de solution saline suivie de 4 % de paraformaldéhyde dans 0,1 M de solution saline tampon de phosphate ou PBS (pH = 7,4), puis retirer et fixer le cerveau.
6. Post-fixer le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 à 3 jours à 4 °C.
7. Intégrez le tissu dans des blocs de paraffine à l’aide d’un équipement d’enrobage de tissus, et évitez de sous-remplir ou de trop remplir la cassette car cela pourrait interférer avec l’alignement ou la section corrects. Faites attention à l’orientation du tissu dans le bloc de paraffine.
   REMARQUE : L’hippocampe du rat, par exemple, est proche de la partie postérieure de l’hémisphère cérébral. Ainsi, le tissu doit être intégré de manière à ce que la section commence à la partie postérieure du cerveau. Utilisez l’atlas de Paxinos comme guide pour atteindre la structure anatomique souhaitée.
8. Placez le microtome à l’abri des courants d’air ou des portes, car les mouvements d’air rendent difficile la manipulation des sections.
9. Utilisez des sections d’une épaisseur ≥20 μm, car cette profondeur sera nécessaire pour produire des images Z-Stack d’astrocytes complets. N’utilisez pas les deux premières sections, car elles peuvent avoir une épaisseur indésirable en raison de la dilatation thermique.
10. Placez les sections à la surface de l’eau chaude (5 ± 2 °C, en dessous de la température de fusion de la paraffine) juste assez longtemps pour aplatir les sections.
    REMARQUE : Une expansion excessive de la section peut perturber la morphologie de la structure. Utilisez un petit pinceau pour transférer soigneusement les sections. Rassemblez deux à trois sections sur chaque diapositive.
11. Rangez les lames dans un support vertical et laissez-les sécher à 37 °C pendant plusieurs heures ou toute la nuit (O/N).

2. Immunohistochimie

1. Déparaffiniser les sections dans le xylène, 2 x 10 min, et réhydrater par gradient d’alcool (99,8 %, 95 % et 70 %, 10 min chacun) et PBS.
2. Incuber avec des anticorps contre la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) dilués à 1:1 500 dans du PBS contenant 0,25 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,25 % de Triton X-100 et 3,5 % de sérum normal (H/N à 4 °C).
3. Laver les sections dans du PBS pendant 3 x 5 min.
4. Incuber avec des anticorps alcalins secondaires conjugués au phosphate pendant 1h (1:100, 21°C, dilués dans du PBS).
5. Lavez les sections dans du PBS pendant 3 x 5 min
   REMARQUE : Il est important de bien laver les sections après les anticorps secondaires afin de minimiser les taches de fond.
6. Incuber les sections dans l’obscurité avec du Chromogène Rouge Permanent Liquide (15-20 min).
   Remarque : Préparez la solution pas plus de 30 minutes avant utilisation.
7. Laver les sections dans du PBS pendant 3 x 5 min.
8. Enfin, colorez les noyaux avec du 4-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; 1:500, dilué dans du PBS) avant de glisser. Conservez les lames au réfrigérateur pendant 24 à 48 heures avant la microscopie.

3. Microscopie confocale

REMARQUE : Pour une évaluation quantitative (voir ci-dessous), sélectionnez un astrocyte avec un noyau clairement visible coloré au DAPI avec un minimum de branches qui se chevauchent pour réduire le risque d’erreurs. La production d’images Z-Stack prend beaucoup de temps. Soyez patient et ne vous arrêtez pas pendant le traitement. Un microscope confocal à balayage laser droit est utilisé pour créer des images 3D d’astrocytes.

1. Placez la lame sur la platine du microscope et sélectionnez l’objectif 63X.
2. Ouvrez le logiciel d’imagerie et cliquez sur Démarrer le système. Cliquez sur l’onglet Localiser. Allez dans Attribuer et sélectionnez GFP pour régler la lumière appropriée.
3. Ouvrez l’obturateur pour réfléchir la lumière. Trouvez le revolver à réflecteur sur le côté droit de l’obturateur et choisissez la couleur qui doit être réfléchie par les astrocytes (vert, rouge ou violet) ; la couleur rouge (FSet20 wf) a été utilisée ici.
   REMARQUE : N’oubliez pas de faire la mise au point de l’image directement dans l’oculaire du microscope.
4. Pour trouver la meilleure mise au point, cliquez sur Tout fermé, mettez la goupille du microscope en mode écran et cliquez sur l’onglet Acquisition.
5. Cliquez sur Smart Setup sous l’onglet Acquisition, une fenêtre s’ouvre. Sélectionnez le fluorophore approprié (c’est-à-dire DAPI et Alexa Fluor 555, dans le projet en cours) dans la liste. La couleur est automatiquement sélectionnée.
6. Cliquez sur Meilleur signal et Appliquer, puis cliquez sur Régler l’exposition ; l’ordinateur définira alors automatiquement les paramètres d’exposition.
7. Pour optimiser l’image, allez dans la fenêtre Canaux. Décochez la piste 2, mettez en surbrillance la piste 1 et cliquez sur Live. Concentrez-vous sur l’image si nécessaire.
8. Dans la fenêtre des canaux, ajustez les touches suivantes ; cliquez sur 1AU pour optimiser automatiquement le sténopé. Il est très important de faire cette étape sinon les images confocales ne seront pas optimales. Ajustez le gain pour avoir la meilleure intensité (maintenez ce réglage en dessous de 800 pour réduire le bruit supplémentaire). Enfin, réglez le gain numérique entre 2 et 3.
9. Décochez la piste 1, cliquez sur la piste 2 et répétez l’étape 3.8 pour la piste 2. Arrêtez ensuite Live.
10. Accédez à la fenêtre Mode d’acquisition. Améliorez l’image en optimisant la taille du cadre et la moyenne. Pour modifier la taille du cadre, allez dans X*Y et sélectionnez 1 024 x 1 024. Choisissez une vitesse lente pour créer une meilleure image.
11. Allez à Calcul de la moyenne et sélectionnez un nombre ≥4. Cette valeur de moyenne indique le nombre de balayages qui seront moyennés pour produire l’image acquise. Maintenant, cliquez sur le bouton Snap et enregistrez l’image 2D capturée.
12. Pour l’imagerie 3D, marquez l’élément Z-Stack sous Smart Setup, ce qui entraîne l’ouverture de la fenêtre Z-Stack.
13. Définissez la première et la dernière position de la pile Z, c’est-à-dire la profondeur de la cellule. Tout d’abord, cliquez sur Live. Utilisez ensuite l’entraînement de mise au point du microscope pour faire la mise au point sur la position la plus haute de l’astrocyte dans le tissu, là où la pile Z doit commencer. Cliquez d’abord sur Définir. Ensuite, concentrez-vous sur la position la plus basse de l’astrocyte dans le tissu, où le balayage Z-Stack doit être arrêté. Cliquez sur Définir en dernier. Arrêtez ensuite Live.
14. Choisissez l’intervalle ; 1,01 μm est utilisé dans l’étude en cours ; le choix de l’intervalle peut se faire en cliquant sur Optimal pour régler le nombre de tranches.
15. Cliquez sur Démarrer l’expérience. Enregistrez les images une fois le balayage terminé. Cette image sera utilisée pour la mesure des paramètres suivants : la surface et le volume du territoire astrocytaire, ainsi que l’ensemble de l’astrocyte, y compris les branches, le corps cellulaire et le noyau.