Administration ciblée de siRNA aux neurones pour le silençage des protéines prions à l’aide de complexes liposomaux

Résumé

Source : Bender, H. R., et.al. Administration de siRNA thérapeutiques dans le SNC à l’aide de liposomes cationiques et anioniques. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre l’administration ciblée de siRNA de protéine prion (PrP) aux neurones à l’aide de complexes siARN-peptide liposomaux (LSPC). Les liposomes cationiques se lient électrostatiquement aux siRNA ciblant la PrP, qui sont ensuite stabilisés par le peptide RVG-9r pour le transport médié par le récepteur à travers la barrière hémato-encéphalique. Une fois à l’intérieur du cerveau, les LSPC subissent une endocytose dans les neurones, libérant des siRNA pour initier l’interférence de l’ARN, réduisant l’expression de la PrP et interrompant la progression de la maladie à prions.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des LSPC

1. Utilisez un rapport 1:1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-triméthylammonium-propane) : cholestérol pour les LSPC. Pour une préparation de liposomes de 4 nmoles, mélanger 2 nmoles de DOTAP et 2 nmoles de cholestérol dans 10 ml d’une solution 1:1 de chloroforme :méthanol dans une fiole.
2. Évaporer 9 ml de la solution chloroforme :méthanol à l’aide du gaz_N2 dans une hotte. Évaporez le dernier 1 ml de solvant dans une hotte pendant la nuit sans gaz. Observez une fine pellicule lipidique au fond de la fiole.
3. Chauffer 10 ml d’une solution de saccharose à 10 % à 55 °C.
4. Verser lentement la solution chauffée de saccharose à 10 % sur la fine pellicule lipidique, c’est-à-dire 1 ml/min, en remuant doucement la fiole. Maintenir le saccharose à 10 % et la fiole contenant les lipides à 55 °C afin que les molécules lipidiques restent en phase gel-liquide. La réhydratation entraîne la formation de vésicules multilamellaires (MLV).
5. Laissez les lipides se réhydrater à 55 °C pendant au moins une heure avant de dimensionner les liposomes.
6. Assemblez une extrudeuse selon les instructions du fabricant avec des filtres de 1,0 μm ou utilisez des filtres de seringue de 1,0 μm pour le dimensionnement.
7. Ajoutez 1 ml de suspension de liposomes chauffée dans l’une des seringues de l’extrudeuse et passez la suspension entre les deux seringues 11 fois. Assurez-vous que la suspension se trouve dans la seringue opposée à celle de la seringue de départ après les 11 passages.
8. Dimensionnez à nouveau les liposomes à travers des filtres de 0,45 μm puis de 0,2 μm pour générer de grandes vésicules unilamellaires (LUV). Gardez la suspension des liposomes chauffée pour faciliter le dimensionnement.
9. Incuber 20 μl de la suspension liposomique de 4 nmole (200 μM) avec 200 μl d’une solution mère de siRNA de 20 μM (4 nmole au total) pendant 10 min à température ambiante.
10. Incuber 80 μl d’une solution mère RVG-9r de 500 μM (40 nmole au total) avec la solution siRNA/liposome pendant 10 min à RT. Les LSPC doivent être utilisés dès que possible, mais peuvent être utilisés jusqu’à plusieurs heures après la préparation. Conserver les LSPC à 4 °C pendant plusieurs heures après la préparation.

2. Injection de LSPC

à des souris

1. Exposez les souris pendant 5 à 10 minutes à une lampe chauffante pour dilater le système vasculaire.
2. Anesthésie la souris avec un débit d’isofluorane/oxygène de 2 à 3 % 5 à 10 minutes avant l’injection et pendant l’injection. Confirmez l’anesthésie lorsque l’animal n’est plus ambulatoire et que la respiration a ralenti, en pinçant l’orteil. Placez la souris sur son dos ou son côté pour accéder à la veine de la queue. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement sous anesthésie.
3. Essuyez/vaporisez la queue avec 70 % d’EtOH et injectez 300 μl de LSPC dans la veine de la queue de la souris à l’aide d’une seringue d’insuline de 26 G. Commencez à injecter distalement dans la veine de la queue et déplacez-vous vers la proximale si la veine s’affaisse ou se rompt.
4. Placez la souris dans une cage propre jusqu’à ce qu’elle maintienne une décubitus sternal. Ne placez pas la souris avec d’autres compagnons de cage tant qu’elle n’est pas complètement rétablie. Les souris devraient se rétablir en 5 à 15 min. Ils peuvent être placés sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante pour maintenir la température corporelle si la récupération prend plus de temps. Les souris doivent être surveillées de près pour se protéger contre la surchauffe.
5. Surveillez l’animal plusieurs heures après l’injection pour vous assurer que l’anesthésie se dissipe et qu’il n’y a pas d’effets néfastes du traitement. Laissez les LSPC circuler pendant au moins 24 heures.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DOTAP lipid	Avanti Lipides	890890
Cholestérol	Avanti lipides	700000
Chloroform	Fisher Scientific	AC268320010
Methanol	EMD Millipore	113351
N₂ Gaz	AirGas
Saccharose	Fisher Scientific	S5-500
Extrudeuse	Avanti Lipids	610023
filtres 1,0, 0,4 et 0,2 μm	Avanti Lipids	610010, 610007, 610006