Imagerie par bioluminescence in vivo de cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau d’une souris

Résumé

Source : Weber, R. Z., et al., Transplantation intracérébrale et suivi de la bioluminescence in vivo des cellules progénitrices neurales humaines dans le cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la méthode d’imagerie par bioluminescence in vivo de cellules progénitrices neurales humaines génétiquement modifiées injectées dans un cerveau de souris. Le processus implique l’injection de luciférine, la préparation de l’imagerie et la détection de signaux bioluminescents à partir des cellules transplantées au site d’injection.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Imagerie in vivo

1. Préparation de la luciférine
   1. Décongelez le sel de potassium de la D-luciférine à température ambiante (RT) et préparez une solution mère fraîche de D-luciférine à 30 mg/mL dans du PBS.
   2. Stérilisez la solution mère à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
      REMARQUE : L’utilisation immédiate de la solution de travail est recommandée. Si nécessaire, la luciférine dissoute peut être conservée à -20 °C. Cependant, un stockage prolongé peut entraîner la dégradation du signal. La luciférine est un réactif sensible à la lumière. Gardez-le à l’abri de la lumière directe dans la mesure du possible. D’autres substrats peuvent également être envisagés, par exemple le cycluc, pour améliorer la limite de résolution.
2. Imaging
   1. Configuration initiale
      REMARQUE : L’imagerie par bioluminescence a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie in vivo (voir le Tableau des matériaux) composé d’une chambre sombre et d’une caméra CCD refroidie.
      1. Double-cliquez sur l’icône du logiciel Living Image et sélectionnez un ID utilisateur dans la liste déroulante.
      2. Cliquez sur Initialiser dans le panneau de configuration qui s’affiche. Une fois le processus d’initialisation terminé, la boîte de température du panneau de commande deviendra verte.
      3. Dans le panneau de configuration, cochez les cases Luminescent et Photographie et sélectionnez Exposition automatique (~60 s). Sélectionnez un champ de vision (D/12.5cm a été choisi pour ce protocole). Entrez la hauteur du sujet (1,5 cm) et sélectionnez l’option Utiliser la hauteur du sujet mise au point. Réglez manuellement les paramètres suivants : grand binning, f/2, filtre d’excitation bloqué et filtre d’émission ouvert.
   2. Déterminer la quantité injectée de D-luciférine à 300 mg/kg de poids corporel.
      REMARQUE : La dose standard recommandée est de 150 mg/kg de D-luciférine. Cette procédure a été ajustée selon un protocole faisant état d’une sensibilité plus élevée à l’aide de 300 mg/kg.
   3. Injecter la luciférine par voie intrapéritonéale (i.p.).
      REMARQUE : Si l’animal a besoin d’être mis sous sédatif avant l’injection, sachez que cela peut prolonger le temps d’expression maximale de la luciférase.
   4. Attendez 5 min, puis anesthésiez les animaux avec un apport continu d’isoflurane (4,5 % dans la phase d’induction et 1,5-2 % dans la phase de maintenance pendant la procédure d’imagerie).
   5. Appliquez un lubrifiant ophtalmique sur les yeux, puis rasez les animaux sous sédatif sur la région de la tête à l’aide d’un rasoir à cheveux conventionnel. Placez les animaux dans la chambre d’imagerie et commencez l’imagerie 15 min après l’injection de luciférine en cliquant sur Acquérir dans le panneau de configuration.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre à seringue pour
Équipement
Coussin			Produit de choix
Système d’imagerie In-Vivo (progiciel IVIS Lumina III avec Living Imaging 4.2)	Perkin Elmer	CLS136334
Vaporisateur d’isoflurane	Provet AG	330724
Pharmaceuticals and Reagents
D-Luciferin Potassium Salt	Perkin Elmer	122799
Éthanol ; 70 %			Produit de choix
Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluoréthyl-difluorométhyléther) 99,9 %)	Provet AG	Tous les produits pharmaceutiques ont été fournis par la pharmacie cantonale, Zurich, Suisse
Lubrifiant ophtalmique (Retinol palmitat : 15 000 UI)	Bausch & Lomb Swiss AG	Tous les produits pharmaceutiques ont été fournis par la pharmacie cantonale de Zurich, en Suisse

consommables ; 0.22 μm TPP 99722 chauffant