Purification chromatographique des ribosomes de levure hautement active

Résumé

La contamination des préparations de ribosomes eucaryotes purifié par les méthodes traditionnelles par les co-purifiant nucléases et protéases une incidence négative sur l'aval des analyses biochimiques et structurelles. Une méthode de purification chromatographique rapide et simple est utilisée pour résoudre ce problème en utilisant des ribosomes levure comme système modèle.

Résumé

Ribosomes eucaryotes sont beaucoup plus labiles par rapport à leurs homologues eubactériennes et archael, posant ainsi un défi important pour les chercheurs. Particulièrement gênant est le fait que la lyse des cellules libère un grand nombre de protéases et nucléases qui peut dégrader les ribosomes. Ainsi, il est important de séparer les ribosomes de ces enzymes aussi rapidement que possible. Malheureusement, les méthodes classiques ultracentrifugation différentielle feuilles ribosomes exposés à ces enzymes pour des périodes trop longues de temps, des répercussions sur leur intégrité structurelle et la fonctionnalité. Pour résoudre ce problème, nous utilisons une méthode chromatographique en utilisant une cystéine chargé Sulfolink résine. Cette application simple et rapide réduit considérablement la co-purifiant activités protéolytiques et nucléolytique, produisant des rendements élevés intacte, les ribosomes levure hautement biochimiquement active. Nous suggérons que cette méthode devrait également être applicable aux ribosomes de mammifères. La simplicité dela méthode, et la pureté améliorée et l'activité des ribosomes purifié par Chromatographie représente un progrès technique important pour l'étude des ribosomes eucaryotes.

Protocole

1. Préparation d'une cystéine chargé Sulfolink de résine

1. Préparer Sulfolink résine (Pierce) à température ambiante.
2. Placer un total de 10 ml d'une suspension de 50% de gel de couplage Sulfolink tel que fourni par le fabricant dans deux flacons de 10 ml en plastique, avec 5 ml distribué dans chaque flacon.
3. Centrifuger brièvement flacons à 850 xg et retirez soigneusement surnageants.
4. Lavez les trois gel de fois dans le tampon de couplage (50 mM Tris, pH 8,5, EDTA 5 mM) par remise en suspension des billes dans 5 ml, centrifuger brièvement à 850 xg et élimination du surnageant à la pipette.
5. Ajoutez cinq ml d'une solution....

Discussion

Protocoles de purification ribosome essentiellement impliquent lyse des cellules, la récolte d'une fraction cytosolique d'une vrille à basse vitesse, puis granulation ribosomes par centrifugation à grande vitesse ^1. Bien qu'un peu de nouvelles méthodes ont été utilisées pour la purification de ribosomes bactériens, le même n'avait pas été vrai pour les eucaryotes ^2-4. Bien que des mesures supplémentaires ont été ajoutés au fil des années, se lave le sel par exemple, et les coussins .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
Sulfolink Couplage de résine	Pierce	20402
Mini-batteur billes 16	Biospec	607
Optima Max E ultracentrifugeuse	Beckman Coulter
Légende RT	Sorvall
0,5 mm Perles de verre	Biospec	11079105
Tris	Sigma-Aldrich	252859
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
TNT	Sigma-Aldrich	43815
HEPES	Sigma-Aldrich	54459
NH 4 Cl	Sigma-Aldrich	A9434
KCl	Sigma-Aldrich	60128
Mg (OAc) 2	Sigma-Aldrich	M5661
KOH	Sigma-Aldrich	221473
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
Puromycine	Sigma-Aldrich	P7255
GTP	Fermentas	R0461