Transplantation de cellules précurseurs d’interneurones d’origine humaine dans l’hippocampe d’un bébé souris

Abstract

Source : Gonzalez-Ramos, A., et. al., Transplantation de neurones GABAergiques dérivés de cellules souches humaines dans l’hippocampe de souris postnatal précoce pour atténuer les troubles neurodéveloppementaux. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo démontre l’injection stéréotaxique de cellules précurseurs d’interneurones dérivées de l’homme dans l’hippocampe d’un chiot souris génétiquement modifié avec des interneurones inhibiteurs réduits, dans le but de rétablir l’équilibre excitateur-inhibiteur.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Transplantation de cellules intrahippocampiques

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section sont effectuées à l’extérieur du capot de culture cellulaire dans l’animalerie. Une transplantation postnatale précoce de cellules dans le cerveau a été réalisée le jour de la naissance P2, en tenant compte de P0

.

1. Préparez-vous à l’expérience de transplantation en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Autoclave tout le matériel chirurgical ou, si ce n’est pas possible, stérilise avec une autre méthode approuvée.
   2. Montez la seringue d’injection dans le support sans aucun capillaire en verre. Rincez l’aiguille à l’eau.
      REMARQUE : L’aiguille doit avoir une taille de 33 G.
   3. Courbez à 90° la pointe d’une aiguille à insuline de 30 G.
   4. Créez une scène maison semblable à de la pâte à modeler pour positionner le chiot avec la tête à plat (figure 1A).
   5. Allez chercher la cage de la souris avec la mère et les chiots avant de préparer quoi que ce soit pour la chirurgie afin de leur permettre de s’acclimater au nouvel environnement.
   6. Préparez un plateau avec de la glace humide et une cage vide avec du papier pour l’isoflurane.
2. Anesthésie le chiot souris.
   1. Trempe une feuille de papier avec de l’isoflurane (voir la Table des Matériaux) et place-la à l’intérieur de la cage vide. Prenez soigneusement un chiot et placez-le dans la cage avec le papier imbibé d’isoflurane.
      REMARQUE : Ne laissez jamais moins de trois chiots avec la maman. Ne dépassez pas 20 à 30 s d’anesthésie à l’isoflurane, sinon le chiot pourrait mourir.
   2. Vérifier l’effet de l’anesthésie par l’arrêt du mouvement.
   3. Immédiatement après l’anesthésie, placez le chiot sur un tissu humide à la surface de la glace humide. Garder l’animal sur de la glace pendant 3 min jusqu’à ce que les membres supérieurs deviennent blanchâtres (figure 1B, flèche bleue). Cela prend généralement 2-3 min.
   4. Profitez de ce temps pour charger la seringue avec la suspension cellulaire. Remettez les cellules en suspension avec précaution à l’aide d’une pipette avant.
   5. Placez le chiot sur le cadre stéréotaxique. Utilisez les barres d’oreille dans la direction opposée (Figure 1A, flèches magenta).
      REMARQUE : La face arrière des barres d’oreille est moins pointue, et comme les chiots P2 n’ont pas d’oreilles, utilisez le côté le plus plat pour éviter de blesser l’animal.
   6. De côté, vérifiez si la tête est droite. La tête doit être plate ; utilisez l’étape de type Play-Doh pour vous adapter à cela.
      REMARQUE : Les chiots de cet âge n’ont pas encore ouvert les yeux, il n’est donc pas nécessaire de prendre des mesures supplémentaires à cet égard. Les chiots n’ont pas de fourrure à cet âge, il n’est donc pas nécessaire de raser la zone. Aucun traitement spécifique de la douleur n’est administré car il ne s’agit pas d’une incision ouverte à la peau et aucune suture n’est impliquée.
   7. Gardez le chiot recouvert de glace (sur du papier de soie) pendant toute la durée de la chirurgie.
      REMARQUE : Ne placez pas la glace en contact direct avec la peau du chiot.
3. Effectuez l’injection.
   1. Nettoyez la surface de la peau à l’aide d’un mouchoir imbibé d’éthanol.
   2. Identifiez lambda et mettez les coordonnées à zéro sur la console d’affichage numérique de l’instrument stéréotaxique (Figure 1C, ligne pointillée jaune). Les sutures sagittales et lambdoïdes sont facilement visibles à l’œil nu car elles sont vascularisées sous forme de lignes rouges.
      REMARQUE : Si vous rencontrez des difficultés à visualiser le lambda, placez un petit morceau de glace sur la peau et attendez quelques minutes qu’il refroidisse. Ensuite, retirez le morceau de glace, et le blanchiment subtil de la peau vous permettra de visualiser.
   3. Déplacez l’aiguille d’injection aux coordonnées souhaitées. Dans le protocole décrit, la région ciblée était l’hippocampe, et les coordonnées étaient les suivantes : antéro-postérieure (AP) +0,85 et médio-latérale (ML) +1,35.
   4. Utilisez une aiguille à insuline pliée à 90° pour pénétrer dans le crâne et créer un petit trou.
   5. Abaissez l’aiguille d’injection jusqu’à ce qu’elle ait traversé le crâne, et mettez à zéro les coordonnées dorso-ventrales (DV). Abaissez l’aiguille jusqu’à ce que les coordonnées DV souhaitées soient. Dans le protocole décrit, les coordonnées étaient DV −1,1.
   6. Injectez selon les intervalles de temps prédéterminés.
      REMARQUE : Dans le protocole décrit, les horaires exacts étaient les suivants : (i) après être descendu jusqu’à la coordonnée DV, attendez 3 min, (ii) injectez 1 μL de volume pendant 5 min, et (iii) une fois que tout le volume a été injecté, attendez 3 min.
   7. Rétractez l’aiguille lentement.
4. Terminez la procédure.
   REMARQUE : La chirurgie ne peut pas durer plus de 15 minutes pour assurer la survie du chiot et éviter tout dommage dérivé de l’anesthésie par l’hypothermie.
   1. Réchauffe le chiot avec les mains jusqu’à ce qu’il commence à bouger avant de le rendre à la mère.
   2. Administrer DOX à une concentration de 1 mg/mL dans une solution de saccharose à 0,5 % sous forme d’eau de boisson pendant au moins 2 jours avant et 3 semaines après la transplantation (TP) pour poursuivre la différenciation cellulaire in vivo.

Results

Figure 1 : Stransplantation téréotaxique chez des bébés souris nouveau-nés à P2. (A) Une scène de type Play-Doh est utilisée pour maintenir le corps du chiot en position et des barres d’oreille inver...

Materials